周文靜1,劉必旺1,張 萌1,王珊珊1,秦 楠

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西晉中 030619;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院,山西晉中 030619)

“霧霾”是指空氣中存在的有毒有害顆粒物與水汽的混合物,是霾與霧的結(jié)混合物,稱為霧霾。近年來(lái),中國(guó)不少地區(qū)都出現(xiàn)了“霧霾天氣”,甚至作為一種災(zāi)害性天氣出現(xiàn),因霧霾可引起呼吸、心血管、生殖系統(tǒng)等多方面疾病[1],人們“談霾色變”。霧霾的元兇PM2.5具有直徑小、毒性強(qiáng)的特點(diǎn),可隨呼吸進(jìn)入支氣管、細(xì)支氣管,最后沉降于肺泡[2],由于缺乏清除措施,可形成慢性肺組織損傷[3]。對(duì)霧霾引發(fā)的健康問(wèn)題不僅需要藥物治療,更需要提前預(yù)防,研究一種有效的抗霾清肺功能食品具有重要意義。

中醫(yī)強(qiáng)調(diào)“正氣存內(nèi),邪不可干”[4],黃芪為常用補(bǔ)氣藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,味甘,微溫,歸肺、脾經(jīng),具有益氣固表、托毒斂瘡、利水消腫等作用[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪具有增強(qiáng)免疫的功能[6],可以治療多種肺系疾病,如肺炎、肺纖維化、肺癌等[7-9]。同時(shí)黃芪作為2018年國(guó)家衛(wèi)計(jì)委新增的藥食同源藥材,具有良好的開(kāi)發(fā)前景。羅漢果(Siraitiagrosvenorii)為葫蘆科多年生藤本植物的果實(shí)[10],是清咽利肺、止咳化痰的首選,其甜度較高,且不產(chǎn)生熱量,安全無(wú)毒,是飲料、糖果行業(yè)上好的原料[11]。梨,百果之宗,具有生津止喝,止咳化痰,清肺去燥的功效,中醫(yī)認(rèn)為燥邪易傷肺,秋燥多食梨。

目前,抗霧霾的功能健康食品包括飲料、保健酒、茶等,其中保健飲料類最受國(guó)內(nèi)研究者關(guān)注[12],但以黃芪為原料的抗霾清肺飲品,未見(jiàn)報(bào)道。本研究以黃芪、羅漢果、梨為原料,其中黃芪甲苷是黃芪中最主要的有效成分,一般含有黃芪的處方或者中成藥都將其作為含量控制指標(biāo)。黃芪甲苷屬于黃芪多糖的一種,其具有較強(qiáng)的生物活性。研究報(bào)道,黃芪甲苷能有效改善PM2.5誘導(dǎo)大鼠的生存狀態(tài),減輕肺水腫和肺組織Mc Guigan病理評(píng)分,從而實(shí)現(xiàn)預(yù)防PM2.5所致急性肺損傷的目的[13]。本研究通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)抗霾清肺飲中黃芪甲苷含量,采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)法優(yōu)化抗霾清肺飲的制備工藝,并進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察其抗霾清肺作用,以期為抗霾清肺飲料開(kāi)發(fā)研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪(膜莢黃芪)、羅漢果(拉江果) 山西維康堂中藥飲片有限公司;黃原膠 河北萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司;白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒 南京建成生物有限公司;皇冠梨、香煙(紅塔山)、蒸餾水 市售;甲醇 天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):105753-20 1809) 上海禾午生物科技有限公司;小鼠(SPF級(jí),BALB/C,生產(chǎn)和使用許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011) 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

Waters2695型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;BS224S1/萬(wàn)電子天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán);霾表M1 漢王科技股份有限公司;DL-5-B低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;ZX-S24型全不銹鋼恒溫水浴鍋 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;II-B(500 mL)型磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司;RSCG01-1型超高溫瞬時(shí)滅菌機(jī) 鄭州玉翔機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗霾清肺飲的制備工藝 工藝流程:黃芪、羅漢果、梨→浸泡→煎煮過(guò)濾→復(fù)煎→離心→調(diào)配→均質(zhì)→罐裝滅菌→冷卻→成品

工藝要點(diǎn):a煎煮與離心:選取一定量黃芪、羅漢果的干燥飲片,將羅漢果敲碎成小塊,加水浸泡30 min。然后加入切成1 cm小方塊的梨,文火煎煮30 min,用兩層紗布過(guò)濾得藥液,靜置。往濾渣中加入水,再次煮沸,文火煎煮20 min,用兩層紗布過(guò)濾,合并煎煮液,濃縮。以3500 r/min的速度離心30 min,棄沉淀,然后進(jìn)行抽濾,得濾液[14]。b調(diào)配與均質(zhì):濾液中直接添加一定量的黃原膠在75 ℃下水浴加熱30 min,并用玻璃棒充分?jǐn)嚢?使黃原膠充分溶解。將配制的飲料于均質(zhì)機(jī)中,在20 MPa壓力下均質(zhì)處理,使溶液中成分物質(zhì)均勻分布。c殺菌與灌裝:在高溫下瞬時(shí)滅菌,滅菌溫度為120 ℃,時(shí)間為5 s。最后無(wú)菌的環(huán)境下灌裝,封口,灌裝的溫度控制在恒溫75 ℃左右,灌裝之后冷卻到室溫[15-16]。

1.2.2 HPLC法測(cè)定黃芪甲苷含量

1.2.2.1 色譜條件 PersilBDSC18(200 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱;流動(dòng)相:乙腈-水(35∶65);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;柱溫35 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

1.2.2.2 溶液制備 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取黃芪甲苷5 mg,加入甲醇,配制成濃度為200 μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:取抗霾清肺飲100 mL置分液漏斗中,加正丁醇溶液提取3次,每次100 mL,用氨試液洗滌3次,每次100 mL,棄去氨試液,取正丁醇層放入水浴鍋中蒸干,最后殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ莸?0 mL量瓶中,用微孔濾膜過(guò)濾,即得供試品溶液。

陰性對(duì)照液溶液的制備:根據(jù)抗霾清肺飲制備工藝,剔除黃芪,按供試品的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 專屬性考察 取黃芪甲苷對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液,分別按“1.2.2.1”中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將冷藏保存的對(duì)照品溶液精密量取,體積為5 mL,加甲醇進(jìn)行等梯度稀釋,稀釋后黃芪甲苷的濃度分別為:10、50、100、150、200 μg/mL。上機(jī)測(cè)量5種濃度的對(duì)照品溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.5 樣品測(cè)定 分別選取不同試驗(yàn)組別的抗霾清肺飲樣品,按照“1.2.2.1”中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以計(jì)算飲料中黃芪甲苷的含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 按照各因素加入水的質(zhì)量體積比進(jìn)行試驗(yàn)。固定反應(yīng)條件為羅漢果3%、梨30%、黃原膠0.15%,考察黃芪添加量(1%、5%、10%、20%、30%)對(duì)黃芪甲苷含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定反應(yīng)條件為黃芪10%、梨30%、黃原膠0.15%,考察羅漢果添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)黃芪甲苷含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定反應(yīng)條件為黃芪10%、羅漢果3%、黃原膠0.15%,考察梨添加量(20%、30%、40%、50%、60%)對(duì)黃芪甲苷含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定反應(yīng)條件為黃芪10%、羅漢果3%、梨30%,考察黃原膠添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)對(duì)黃芪甲苷含量和感官評(píng)價(jià)的影響,從而確定各因素的最佳添加量。

表1 感官評(píng)分測(cè)試評(píng)價(jià)Table 1 Sensory score test evaluation

1.2.4 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 本測(cè)試由20名有評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的專家組成評(píng)審組,以外觀、香氣、色澤、口感、組織狀態(tài)五個(gè)方面為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定。取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值作為試驗(yàn)最終記錄值。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定黃芪、羅漢果、梨、黃原膠的因素水平。根據(jù)飲料中黃芪甲苷含量和對(duì)飲料感官品質(zhì)的影響,采用 L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2 抗霾清肺飲正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experimentfor anti-haze Qingfei drink

1.2.6 抗霾清肺飲功效測(cè)定

1.2.6.1 造模及給藥 SPF級(jí)昆明小鼠40只,雌雄各半,體重18～20 g,隨機(jī)分為空白組,模型組,抗霾清肺飲預(yù)防組,抗霾清肺飲治療組,每組10只。適應(yīng)飼養(yǎng)一周,預(yù)防組提前給藥1周,灌胃按照1.5 mL/10 g抗霾清肺飲,每天2次,連續(xù)7 d。除空白組外,其余各組采用連續(xù)香煙煙霧暴露法建立霧霾小鼠模型,將小鼠置于塑料鼠籠中,蓋好蓋子,將3支香煙置于蓋子上,將另一鼠籠倒扣于蓋子上,制成半密閉空間,讓煙自然燃燒,15 min后打開(kāi)熏煙頂蓋,待煙霧全部散去,小鼠休息5 min,然后再次點(diǎn)燃3支香煙重復(fù)上述步驟,每天熏煙2次,每次2 h,并用霾表實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),保證PM2.5濃度超標(biāo),通過(guò)檢測(cè)小鼠病理切片,保證造模成功[17-18]。從第8 d開(kāi)始治療組灌胃抗霾清肺飲,每日2次,連續(xù)7 d,其余各組灌予相應(yīng)劑量生理鹽水。

1.2.6.2 肺組織病理檢測(cè) 于末次給藥后禁食12 h,將老鼠處死,取同一部位肺組織,放入10%甲醛溶液中固定,制備切片,HE染色,光鏡觀察。

1.2.6.3 TNF-α、IL-6含量測(cè)定 用0.25 mol/L蔗糖溶液制備肺組織勻漿,離心取上清液[19],按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定TNF-α、IL-6含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測(cè)定黃芪甲苷含量

2.1.1 專屬性考察結(jié)果 圖1結(jié)果顯示抗霾清肺飲供試品溶液色譜圖呈現(xiàn)與黃芪甲苷對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間的色譜峰,且基線平穩(wěn)、分離度好,而陰性對(duì)照品溶液在此保留時(shí)間無(wú)色譜峰。

圖1 黃芪甲苷高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of astragaloside IV

2.1.2 線性關(guān)系考察結(jié)果 以黃芪甲苷濃度為橫坐標(biāo)(Y),峰面積值為縱坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得回歸方程為:Y=31.912X+462.46(r=0.9998)。結(jié)果顯示黃芪甲苷在10～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以黃芪甲苷含量和感官評(píng)分為考察指標(biāo),確定各因素的最佳添加量。圖2A顯示,在其它因素固定的情況下,黃芪添加10%與20%時(shí),黃芪甲苷含量最高為0.83 mg/mL。結(jié)合感官評(píng)分,當(dāng)黃芪添加10%時(shí),感官評(píng)分最高?？赡苡捎谒幉谋旧砭哂袧饬业亩剐任?隨著添加量增加,掩蓋了其他原料的味道,藥味太濃。而用量較少時(shí),飲料香味偏淡,味道不突出。確定以黃芪添加量10%進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖2B顯示,當(dāng)羅漢果添加量為1%與2%時(shí)黃芪甲苷含量最高,但隨著羅漢果添加量增加,黃芪甲苷含量降低,可能由于配伍作用后影響黃芪甲苷含量。羅漢果添加量2%時(shí)感官評(píng)分最高,隨著用量加大,羅漢果甜味過(guò)濃,感官評(píng)分值也降低。綜合評(píng)定,確定羅漢果添加量為2%。

圖2 不同因素對(duì)飲料黃芪甲苷含量和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of different factors on astragaloside IV contents and sensory score of drink

圖2C顯示,梨的添加量為30%、40%、50%時(shí),黃芪甲苷含量均為0.82 mg/mL,可以發(fā)現(xiàn)不同添加量的梨對(duì)黃芪甲苷含量影響不明顯。梨味道香甜,添加量50%時(shí),飲料有淡淡果味香氣,感官評(píng)分最高,確定梨的添加量為50%。

圖2D顯示,黃原膠添加量為0.1%時(shí),黃芪甲苷含量最高,且口味較協(xié)調(diào),感官評(píng)分亦最高,當(dāng)黃原膠添加較多時(shí),飲料不清亮,給人不愉快感。確定黃原膠添加量為0.1%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

抗霾清肺飲的主要成分為黃芪,其中黃芪甲苷是防治PM2.5,發(fā)揮抗霾清肺作用的主要有效成分[13],而感官評(píng)分是描述和判斷產(chǎn)品質(zhì)量最直觀的指標(biāo),直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量與安全控制,因此設(shè)定黃芪甲苷的權(quán)重為0.5,感官評(píng)分的權(quán)重為0.5。根據(jù)公式(綜合評(píng)分=[(黃芪甲苷含量/黃芪甲苷含量最大值)×0.5+(感官評(píng)分/感官評(píng)分最大值)×0.5]×100)計(jì)算,再以綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析。表3可知,最佳工藝參數(shù)為A1B2C2D2。影響因素依次為A>C>D>B,可見(jiàn)黃芪添加量是最主要因素,影響最為突出,梨添加量次之,黃原膠添加量對(duì)品質(zhì)的影響僅次于梨,羅漢果添加量對(duì)飲料影響最小。由此可得加入9%黃芪、2%羅漢果、50%梨、0.1%黃原膠口感最佳,為最優(yōu)配比。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了確保該制備工藝的可行性與合理性,按照優(yōu)選的試驗(yàn)方案,進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表4,三批抗霾清肺飲的黃芪甲苷含量為0.83～0.85 mg/mL,均值為0.84 mg/mL,黃芪甲苷含量與文獻(xiàn)報(bào)道含黃芪的口服液中含量相近[20-21]。且感官評(píng)分均分為94.67分,接近于正交試驗(yàn)中最大值,表明抗霾清肺飲制備工藝穩(wěn)定。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Results of verification test(n=3)

2.5 抗霾清肺飲功能試驗(yàn)

2.5.1 HE染色結(jié)果 空白組肺組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清楚,未見(jiàn)明顯病變;模型組肺組織表現(xiàn)間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),瘀血,間質(zhì)增厚,吞噬細(xì)胞增多,肺泡擴(kuò)張,細(xì)支氣管粘膜可見(jiàn)輕度增生;預(yù)防組與治療組較模型組均有所減輕,未見(jiàn)粘膜炎癥反應(yīng)及分泌物,見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肺臟病理組織切片(HE,200×)Fig.3 Lung pathological sections ofmice in each group(HE,200×)

2.5.2 TNF-α、IL-6檢測(cè)結(jié)果 TNF-α為炎癥反應(yīng)啟動(dòng)因子,可調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子IL-6的釋放,進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥發(fā)生,引起肺組織損傷[22-24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組TNF-α、IL-6含量極顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,治療組TNF-α、IL-6含量極顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),預(yù)防組TNF-α含量極顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表5。說(shuō)明抗霾清肺飲可以降低霧霾小鼠肺臟的炎性反應(yīng),通過(guò)抗炎而發(fā)揮作用。

表5 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6含量比較Table 5 Comparison of contents of TNF-αand IL-6 in lung tissues of mice in each group

3 結(jié)論

本研究采用中藥傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法,遵循傳統(tǒng)劑型,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)確定黃芪液添加量9%,羅漢果添加量2%,梨添加量50%,黃原膠添加量0.1%;在此配方下該產(chǎn)品呈黃棕色,均勻透亮,梨的果香與藥香味相結(jié)合,酸甜適中,口感適宜。功能實(shí)驗(yàn)表明,抗霾清肺飲可能通過(guò)降低霧霾模型小鼠的炎性反應(yīng)而發(fā)揮治療定作用,且發(fā)現(xiàn)治療效果優(yōu)于預(yù)防效果,該產(chǎn)品可作為抗霧霾的有效功能飲品,具有廣闊的市場(chǎng)前景。