白愛紅 李榮香 謝文燕 滕少俠 胥 博 周美霞 付秀虹

河南省漯河市中心醫(yī)院(462000)

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)在妊娠者中發(fā)生率為1%[1]，發(fā)病機(jī)制可能與基因多態(tài)性有關(guān)[2]。雌激素主要通過雌激素受體(ESR)發(fā)揮作用,其中雌激素受體1(ESR1)在排卵、卵泡生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)ESR1基因多態(tài)性與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤等發(fā)生有關(guān)[4]，與URSA關(guān)系研究不多。本研究通過對(duì)URSA患者血清中ESR1基因型分布進(jìn)行分析，探究ESR1基因型與URSA發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年4月—2018年7月本院治療的URSA患者88例，年齡(31.7±5.7)歲(20～37歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷、家族史、體查、輔助檢測(cè)等確診；②自然流產(chǎn)≥2次，孕期≤3個(gè)月；③生殖器官正常，伴侶雙方染色體正常；④患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重感染者；②黃體功能不全者；③甲狀腺功能異常、糖尿病；④免疫系統(tǒng)異常，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗精子抗體陽性；⑤不良生活習(xí)慣，吸煙、酗酒。另選同期本院體檢的70例健康女性作為對(duì)照組，年齡(32.7±6.2)歲(22～38歲)，妊娠≥3次。兩組年齡比較無差異(P>0.05)。

1.2 樣本采集

所有受試者入院后采集靜脈血離心保存上清，-20℃保存；于月經(jīng)周期2～3d采集靜脈血，檢測(cè)血清激素水平。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1主要試劑與儀器血液DNA提取試劑盒購于美國Sigma Aldrich公司；ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210 位點(diǎn)擴(kuò)增引物由上海生工合成；PCR擴(kuò)增試劑盒購于日本Takara公司；E2檢測(cè)試劑盒購于武漢博士康生物工程有限公司；促卵泡生成激素(FSH)檢測(cè)試劑盒購于武漢明德生物科技股份有限公司;促黃體生成激素(LH)檢測(cè)試劑盒購于上海信裕生物科技有限公司。

1.3.2基因分型檢測(cè)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測(cè)ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位點(diǎn)多態(tài)性，50 μl PCR反應(yīng)體系：5μl Taq Buffer 5μl，3μl MgCl2溶液，位點(diǎn)上下游引物各2μl，1μl dNTP Mix，4μl DNA樣品，0.5μl Taq DNA，補(bǔ)充dd H2O至50μl。擴(kuò)增程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，退火45 s(rs22234693溫度60℃，rs9340799溫度64.3℃，rs2046210溫度62℃)，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取2μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠電泳中觀察條帶變化，回收產(chǎn)物條帶送公司測(cè)定序列。

1.3.3血清激素測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清雌二醇 (E2)水平，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)FSH水平，膠體金法檢測(cè)血清LH水平。

1.3.4結(jié)果判定根據(jù)電泳條帶，確定ESR1基因多態(tài)性。①rs22234693野生型純合子CC型，1條帶1300bp；CT型3條帶 1300bp、850bp、450bp；突變純合子TT型，2條帶850bp、450bp；②rs9340799 野生型純合子AA型，1條帶1300bp；AG型 3條帶，1300bp、910bp、390bp； 突變純合子TT型，2條帶910bp、390bp；③rs2046210 野生型純合子CC型，1條帶1300bp； 雜合子CT型 3條帶，1300bp、875bp、425bp；突變純合子TT型，2條帶875bp、425bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

URSA組FSH水平高于對(duì)照組，E2、LH水平低于對(duì)照組(P<0.0.5)。見表1。

表1 兩組性激素水平比較

2.2 ESR1基因多態(tài)性

rs22234693存在單核苷酸多態(tài)性，包括野生型純合子CC型，1條帶1300bp；突變雜合子CT型共3條帶，1300bp、850bp、450bp；突變純合子TT型，2條帶850bp、450bp。rs9340799存在單核苷酸多態(tài)性，包括野生型純合子AA型，1條帶1300bp；突變雜合子AG型共3條帶，1300bp、910bp、390bp；突變純合子TT型，2條帶910bp、390bp。rs2046210 存在單核苷酸多態(tài)性，包括野生型純合子CC型，1條帶1300bp；突變雜合子CT型共3條帶，1300bp、875bp、425bp；突變純合子TT型，2條帶875bp、425bp。電泳見圖1。

圖1 rs22234693、rs9340799、rs2046210 PCR-CTPP產(chǎn)物電泳圖

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證

兩組ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位點(diǎn)實(shí)際基因頻率與預(yù)測(cè)值比較無差異(P>0.05)；ESR1基因rs22234693、rs9340799、rs2046210位點(diǎn)基因頻率表現(xiàn)穩(wěn)定，符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表2。

表2 兩組ESR1基因各位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)(實(shí)際值/理論值)

2.4 各組各基因型頻率對(duì)比

URSA組rs22234693位點(diǎn)T等位基因、rs9340799位點(diǎn)G等位基因、rs2046210位點(diǎn)T等位基因頻率均高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組各基因型位點(diǎn)頻率對(duì)比

2.5 各基因型與激素水平關(guān)系

rs22234693、rs9340799、rs2046210位點(diǎn)突變型者血清E2、LH水平有差異(P<0.05)，F(xiàn)SH水平比較無差異(P>0.05)。見表4。

表4 ESR1各位點(diǎn)基因分型性激素水平比較

2.6 URSA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的logistic回歸性分析

多因素回歸分析顯示，以rs22234693 CC等位基因、rs9340799 AA等位基因、rs2046210 CC等位基因作參照，rs22234693 TT和TC基因攜帶者發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為CC等位基因的1.756倍和2.432倍，rs9340799 GG、AG基因攜帶者發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為AA等位基因的1.237倍和1.746倍，rs2046210 TT和TC基因攜帶者發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為CC等位基因的1.354倍和1.824倍，均有更高發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P均<0.05)。見表5。

表5 ESR1基因多態(tài)性與URSA發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的logistic回歸分析

3 討論

URSA發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前研究認(rèn)為自身免疫疾病、內(nèi)分泌異常、基因異常是導(dǎo)致其發(fā)病的重要原因，但具體機(jī)制尚未闡明[5]。近期研究顯示其發(fā)病機(jī)制可能與URSA基因多態(tài)性相關(guān)，如免疫相關(guān)基因、內(nèi)分泌相關(guān)基因等[6]，探究URSA基因多態(tài)性對(duì)該病的診斷、治療有積極意義。

ESR基因包含ESRɑ(ESR1)與ESRβ(ESR2)兩個(gè)亞基，目前研究較多的熱點(diǎn)ESR1多態(tài)點(diǎn)為rs22234693、rs9340799，位點(diǎn)發(fā)生基因突變后影響后續(xù)的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)，使ESR1蛋白功能發(fā)生異常，導(dǎo)致組織ER生物效應(yīng)改變。多項(xiàng)研究證實(shí)ESR基因多態(tài)與腫瘤、肥胖、骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。

rs22234693位點(diǎn)為ESR1基因主要功能轉(zhuǎn)錄區(qū)域，該位點(diǎn)突變影響蛋白表達(dá),引發(fā)各種疾病。Elbeshbishy等通過對(duì)子癇前期及正常妊娠者進(jìn)行對(duì)照研究顯示，rs22234693位點(diǎn)C→T突變可增加子癇前期發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9]。Boudjenah等研究顯示rs22234693位點(diǎn)基因多態(tài)性與妊娠率有關(guān)，CC、TC基因型攜帶者卵泡數(shù)量顯著高于TT基因攜帶者，妊娠率低于TT基因攜帶者[10]。Pan等研究發(fā)現(xiàn)rs22234693位點(diǎn)基因多態(tài)性與URSA相關(guān)[11]。Silva等研究發(fā)現(xiàn)rs22234693位點(diǎn)多態(tài)性影響絕經(jīng)后婦女月經(jīng)周期和生殖參數(shù)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)URSA患者rs22234693位點(diǎn)CC、TC、TT基因型頻率比較有差異性，且T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，提示rs22234693位點(diǎn)多態(tài)性可能與URSA有關(guān)。臨床分析顯示兩組rs22234693位點(diǎn)血清E2、LH水平具有差異，提示rs22234693位點(diǎn)突變后影響ESR1轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)，導(dǎo)致ESR1蛋白功能發(fā)生異常，可能進(jìn)一步影響血清E2、LH。logistic分析發(fā)現(xiàn)rs22234693位點(diǎn)rs22234693 TT和TC基因攜帶者的發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為CC等位基因的1.756倍和2.432倍，推測(cè)rs22234693位點(diǎn)C基因型突變?yōu)閁RSA發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

rs9340799位點(diǎn)基因多態(tài)性與多類疾病的發(fā)生有關(guān)[13-14]。近期發(fā)現(xiàn)與妊娠并發(fā)癥有關(guān)，例如rs9340799位點(diǎn)GG基因型與重度子癇前期有關(guān)[15]。Anousha等研究認(rèn)為自然流產(chǎn)患者rs9340799位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，可能是造成自然流產(chǎn)的原因[16]。最新一項(xiàng)研究認(rèn)為ESR1 rs9340799多態(tài)性與非亞洲組RSA風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，而與亞洲組發(fā)生RSA風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，這可能與種族差異有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)URSA組rs9340799位點(diǎn)AA、AG、GG基因型比較有差異性，且G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，提示rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性可能與URSA有關(guān)。臨床分析顯示兩組rs9340799位點(diǎn)血清E2、LH水平具有差異，提示rs9340799位點(diǎn)突變后影響ESR1轉(zhuǎn)錄，造成ESR1蛋白水平、功能異常，進(jìn)一步影響血清E2、LH水平。logistic分析發(fā)現(xiàn)rs9340799位點(diǎn) AG、GG基因攜帶者發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為AA等位基因的1.237倍和1.746倍，推測(cè)rs9340799位點(diǎn)A基因型突變?yōu)閁RSA發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

rs2046210定位正在染色體6q25.1 ERS1上游，其編碼的 ERS1蛋白通過與雌激素結(jié)合發(fā)揮雌激素代謝功能。過往研究顯示該位點(diǎn)對(duì)乳腺癌具有強(qiáng)烈的預(yù)測(cè)作用[18]。羅力等研究發(fā)現(xiàn)rs2046210 TT基因型攜帶者可增加乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)，為乳腺癌遺傳易感性基因[19]。然而rs2046210基因多態(tài)性與URSA的關(guān)系還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)URSA組rs9340799位點(diǎn)各基因型比較有顯著性，提示rs2046210位點(diǎn)多態(tài)性可能與URSA的發(fā)生相關(guān)。通過臨床分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2046210基因多態(tài)性會(huì)影響URSA組血清E2、LH水平，logistic分析發(fā)現(xiàn)rs2046210 TT和TC基因攜帶者發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為CC等位基因的1.354倍和1.824倍，提示rs2046210 T等位基因可能與URSA的遺傳易感性相關(guān)，具有T等位基因的女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)更高。

綜上所述，ESR1 rs22234693多態(tài)性等位基因T、rs9340799等位基因G、rs2046210等位基因T突變會(huì)影響患者血清雌激素水平，增加女性發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)。因此ESR1基因多態(tài)性可能成為URSA發(fā)病機(jī)制以及治療的重要依據(jù)之一，臨床治療前應(yīng)先確定患者的基因型，不同基因型采取不同治療方案。然而本研究僅對(duì)ESR1 rs22234693、rs9340799、rs2046210位點(diǎn)進(jìn)行研究，且納入病例數(shù)量不多，后續(xù)需要擴(kuò)大樣本量深入研究ESR1基因，為URSA發(fā)病機(jī)制、臨床治療提供更充分的理論依據(jù)。