郭昭鵬 吳群燕 陳仕國 林 圣 鄭開封 蘇進(jìn)娣 姚克勤 段 山*

1. 深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院(518019)；2.深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心

葡萄糖-6磷酸脫氫酶( G6PD)缺乏癥是世界范圍內(nèi)常見的遺傳性疾病，是由G6PD基因中的點(diǎn)突變導(dǎo)致酶活性的異常。廣東省是中國南部沿海人口最多的省份，一直被稱為“百種族”，G6PD缺乏癥發(fā)生率為3.1%～16.1%[1]，在深圳地區(qū)具有比較高的發(fā)病率[2-3]，但以往的研究沒有對深圳地區(qū)的致病基因突變譜進(jìn)行大規(guī)模人群系統(tǒng)分析。為了今后能高效開展本地區(qū)G6PD缺乏癥基因篩查，本研究在深圳地區(qū)育齡人群中開展了G6PD缺乏癥致病相關(guān)基因突變譜的篩查。

1 對象和方法

1.1 研究對象

來自深圳原羅湖區(qū)和原龍崗區(qū)計(jì)劃生育中心體檢育齡夫婦的靜脈血樣本共6389例，其中經(jīng)過G6PD/6GPD比值法初篩G6PD陽性樣本749例及未經(jīng)酶活性篩查的樣本5640例。本研究經(jīng)深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1G6PD/6PGD比值法采用G6PD測定試劑盒(廣州科方生物技術(shù)有限公司)，在COBAS8000全自動生化免疫分析系統(tǒng)(ROCHE, USA)上進(jìn)行G6PD酶活性檢測。正常參考值為1.00～2.30；<0.95為G6PD缺乏，判斷為陽性；>1.05為G6PD酶活性正常，判斷為陰性；0.95～1.05為可疑，予以復(fù)查后判定。

1.2.2ARMS-PCR法通過優(yōu)化引物和擴(kuò)增條件，檢測中國人常見的6種基因突變型：c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.392 G>T、c.1024C>T[4]。抽取10%的樣本進(jìn)行sanger測序驗(yàn)證ARMS-PCR法檢測的準(zhǔn)確性，結(jié)果100%準(zhǔn)確，沒有發(fā)現(xiàn)檢測錯誤樣本。

1.2.3二代測序(NGS)用ARMS法排除6個(gè)常見位點(diǎn)的樣本后進(jìn)行NGS全序列測序檢測，擴(kuò)增方案見參考文獻(xiàn)[5]。NGS全序列測序分析見參考文獻(xiàn)[6]。數(shù)據(jù)分析采用Ion Torrent PGMTM服務(wù)器配套的Ion Torrent Software Suite數(shù)據(jù)分析軟件對電信號進(jìn)行捕獲和轉(zhuǎn)換，并結(jié)合自帶插件coverageAnalysis和variantCaller對測序結(jié)果進(jìn)行初步分析。

2 結(jié)果

2.1 基因突變類型

6389例樣本中發(fā)現(xiàn)1180例存在基因突變， 檢出23種基因突變類型。女性樣本中檢出14例純合子(1388G>A純合突變 7 例， 1376G>T 純合突變 7例)及28例雙重雜合子(c.95 A>G/c.1376 G>T復(fù)合突變8例、c.95 A>G/c.1388 G>A復(fù)合突變7例、c.1376 G>T/c.1388 G>A復(fù)合突變13例)。見表1。研究還發(fā)現(xiàn)了4例新突變類型，分別為c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，見表2。

表1 6389例樣本ARMS-PCR結(jié)合NGS全序列分析檢出基因突變類型

表2 4例未見報(bào)道基因突變類型及G6PD/6PGD比值法檢測結(jié)果

2.2 基因突變率

5640例樣本檢出有基因突變442例，占7.8%，其中男性148例，占男性樣本10.0%(148/1479)；女性294例，占女性樣本7.0%(294/4161)。

2.3 漏診率和假陽性率

經(jīng)酶活性檢測的5640例中，陰性5280例(男性1331例、女性3949例)中發(fā)現(xiàn)基因突變率1.8%(96/5280)，其中男女性漏診率分別為0.3%(3/1331)和2.4%(93/3949)。而在酶活性檢測為陽性的360例(6.4%)及之前收集的749例G6PD陽性樣本中，共計(jì)有25例經(jīng)過全序列測序分析未發(fā)現(xiàn)基因突變，誤診率為2.2%(25/1109)。

3 討論

G6PD缺乏癥，俗稱蠶豆病，是由于編碼紅細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的基因突變，引起溶血性貧血的一種遺傳性酶缺乏病[7]。G6PD 基因突變具有明顯的地區(qū)和種族異質(zhì)性，在我國其分布呈“南高北低”的趨勢，患者主要分布在長江以南各省，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高，其發(fā)病率可達(dá) 4.2%～15.7%[8]。編碼G6PD的基因突變類型以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎澜绺鞯匾寻l(fā)現(xiàn)超過200種異常G6PD基因型，中國人群已發(fā)現(xiàn)35種[9]。本研究歷時(shí)3年，共計(jì)對6389例孕前篩查的育齡人群開展了ARMS-PCR法結(jié)合NGS全序列分析方法檢測G6PD基因突變的研究，取得了本地區(qū)G6PD基因突變譜的第一手資料。

3.1 中國深圳地區(qū)育齡人群G6PD基因突變類型的流行特征

本研究中得到G6PD缺乏癥酶活性異常率為6.4%，G6PD缺乏癥的基因型突變率為7.8%，其中男女性占比分別為10.0%和7.0%，高于佛山、東莞、潮州等廣東省其他地區(qū)報(bào)道的G6PD基因突變率[10-12]。結(jié)果的差異性可能與樣本量和地區(qū)人群起源的差異有關(guān)。G6PD在不同種族和人群中的致病基因突變類型和發(fā)生頻率有高度遺傳異質(zhì)性。本研究共對6389例樣本進(jìn)行基因突變篩查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)常見突變類型構(gòu)成比與中國南方人群常見的12種突變類型基本相符[13]。檢出的c.592C>T、c.1360C>T、c.487G>A、c.949G>A,突變分別在印度、意大利和東南亞較為常見[14]。本研究檢測出1例突變類型為c .592C> T，據(jù)報(bào)道是中國侗族最常見的突變類型，占侗族G6PD基因突變的50%以上[15]。目前報(bào)道東南亞種群中常見的突變類型為c.95A>G，c.392G>T，c.1360C>T，c.1376G>C，c.1388G>A和c.871G>A[16]。本研究結(jié)果同樣顯示具有亞洲種群的突變特征，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)較多中國人群罕見的突變類型，說明深圳地區(qū)作為一個(gè)年輕的移民城市，由于匯聚了來自全國各地的新移民，從遺傳學(xué)角度看本地區(qū)人群具有高度的遺傳異質(zhì)性和代表性，因而有許多中國人罕見的基因突變類型得以在本地區(qū)人群中檢出。這也提示深圳地區(qū)人群是篩查中國人群常見遺傳性疾病基因突變譜的理想人群。G6PD全基因序列測序發(fā)現(xiàn)的c.460A>G、c.226A>C、c.-6T>C、c.452C>G，4個(gè)基因突變經(jīng)過Pubmed、HGMD、dbSNP、LOVD、Ensembl數(shù)據(jù)庫檢索均未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。

3.2 G6PD基因檢測方法比較

目前，診斷G6PD缺乏癥主要的檢測方法包括酶活性檢測法和基因檢測法兩大類。臨床上多采用酶活性檢測法[17]。G6PD/6PGD比值法對于女性雜合子的漏檢率約在20%[18]。

ARMS-PCR是一種常用檢測已知點(diǎn)突變的方法，具有簡單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確優(yōu)點(diǎn)[19]。本研究首先用ARMS-PCR法對6389例樣本進(jìn)行G6PD基因的6個(gè)常見突變位點(diǎn)進(jìn)行快速低成本篩查，大大節(jié)約了研究的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本。二代測序(NGS)[20]由于測序成本較高，目前的報(bào)道中尚未見將這一方法大規(guī)模用于臨床檢測。但由于其在高通量、全基因范圍內(nèi)篩查已知和未知突變方面的獨(dú)特優(yōu)勢，本研究采用本課題組開發(fā)的長片段PCR捕獲結(jié)合NGS測序的目標(biāo)序列測序方法對未篩查到常見突變的樣本進(jìn)行了G6PD基因全基因序列測序分析，測序范圍包括基因前后端5000bp范圍的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)及所有外顯子內(nèi)含子區(qū)域，以便能夠全面篩查可能存在的中國人群罕見G6PD突變和/或未知突變。

本研究對5640例樣本先進(jìn)行G6PD/6PGD比值法鑒定后再予以基因法檢測，G6PD/6PGD比值法漏診率1.8%，誤診率為2.2%。原因可能有以下幾點(diǎn)：①不同基因突變導(dǎo)致的酶活性缺乏的表現(xiàn)度不一。②女性雜合子突變由于X染色體隨機(jī)失活或者DNA甲基化程度各異導(dǎo)致酶活性的缺失程度差異較大。G6PD/6PGD比值法檢測結(jié)果靠近正常臨界值甚至正常，需要在G6PD/6PGD比值法檢測的基礎(chǔ)上結(jié)合基因突變檢測來提高G6PD缺乏癥的篩查準(zhǔn)確率。

本研究在部分G6PD/6PGD法檢出的G6PD酶活性正常樣本中用本方法也檢測出編碼區(qū)的有效錯義突變，是目前較為全面和可靠的方案。本研究發(fā)現(xiàn)的4例尚未見報(bào)道的基因突變類型，除了c.460A>G突變女性攜帶者酶活性正常外，其它3種突變的男性攜帶者其酶活性都顯著下降，由于 X 染色體隨機(jī)失活,攜帶G6PD 基因突變的女性雜合子會形成酶缺乏紅細(xì)胞與正常紅細(xì)胞的嵌合，故其酶活性差異較大。它們與G6PD致病的相關(guān)性以及造成的酶缺乏程度等致病機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究揭示。

綜上所述，本項(xiàng)研究在深圳地區(qū)開展了較大規(guī)模的系統(tǒng)性G6PD基因突變篩查研究，獲得了較明確的深圳地區(qū)常見的G6PD基因突變譜。并對G6PD/6PGD比值法篩查G6PD缺乏癥的漏診率和誤診率進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析。對改進(jìn)現(xiàn)有臨床G6PD/6PGD比值法提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐，為研發(fā)適合本地區(qū)出生缺陷預(yù)防的G6PD缺乏癥基因診斷試劑盒提供理論基礎(chǔ)。

(志謝：深圳市人口基金會為本研究項(xiàng)目提供的研究資金支持)