暴 國(guó) 張長(zhǎng)勇 饒 永 徐祥波 陳西華 鄭玉峰 賀 斌*

1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081)；2.吳江永元生物科技有限公司；3.北京大學(xué)工學(xué)院材料與工程系

美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心、世界衛(wèi)生組織、FSRH、美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)等重要組織機(jī)構(gòu)認(rèn)為放置宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)是適用于多種女性人群的安全避孕方法，近年來(lái)國(guó)外甚至推薦IUD作為一種緊急避孕方法[1]。盡管IUD被公認(rèn)是可逆、高效的長(zhǎng)效避孕方法，但仍存在不少臨床問(wèn)題。我國(guó)《12萬(wàn)例宮內(nèi)節(jié)育器避孕效果調(diào)查報(bào)告》大樣本研究顯示，20年來(lái)，雖然IUD避孕有效率明顯提高和品種大量增加，但出血、感染、腹痛、腰痛等副反應(yīng)卻沒(méi)有下降。與20世紀(jì)80年代初期研究相比，有的副反應(yīng)甚至升高[2]。已有研究顯示Cu2+的暴釋是副反應(yīng)產(chǎn)生的重要因素之一[3]。2012年，鄭玉峰等在未引入任何新元素和新材料情況下，通過(guò)多道次擠壓方法制備新型超細(xì)晶銅材料，體外實(shí)驗(yàn)顯示比普通銅具有更高的強(qiáng)度、更低的腐蝕速率，完全可接受的Cu2+釋放行為以及更好的生物相容性[4]。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究以新型超細(xì)晶銅材料制備銅絲與現(xiàn)有IUD銅材料植入大鼠子宮，探究銅材料在動(dòng)物體內(nèi)的Cu2+釋放及對(duì)子宮影響。

1 材料與方法

1.1 銅材料制備

普通銅材料由重慶南桐節(jié)育器廠(GCu200-20×22/日本銅絲，標(biāo)稱(chēng)純度99.99%)生產(chǎn)，銅絲直徑0.4-00.04mm。新型超細(xì)晶純銅材料由江蘇吳江永元生物科技有限公司制備，標(biāo)稱(chēng)純度99.99%，銅絲直徑0.3-00.03mm，制備方法按照鄭玉峰的塊體金屬制備方法[4]，并在江蘇蘇州拉制成絲。兩種銅材樣品依次經(jīng)過(guò)丙酮、無(wú)水乙醇及去離子水中超聲波清洗，吹干。普通銅材料截取5.3 cm銅絲(59 mg，表面積(2πr2+2π·r·L=0.67 cm2)，新型超細(xì)晶銅材料截取7.1 cm銅絲(45 mg，表面積0.67 cm2)后，銅絲彎曲成螺旋管狀備植入用。以TCu380 IUD用于體質(zhì)量50 kg成年人核算，250 g大鼠應(yīng)用銅面積約1.9 mm2[5]，植入一節(jié)銅絲螺旋管于1只250 g大鼠銅劑量為成年人的0.67 cm2/1.9 mm2=35.2倍。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡Wistar雌性大鼠60只(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重200～250 g，按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各30只。飼養(yǎng)于本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，光照周期為明暗交替各12h，每天早8：00開(kāi)燈，晚20：00關(guān)燈。環(huán)境溫度21±1℃，相對(duì)濕度60%～80%，動(dòng)物自由采食及飲水。實(shí)驗(yàn)研究遵循本所倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.3 銅材料植入及取材

大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后，背部正中偏下方左側(cè)切口入腹腔，找到左側(cè)子宮后將子宮角輕拉出腹腔，距子宮角遠(yuǎn)端約1 cm處將子宮壁剪開(kāi)一小口，將銅絲螺管置于大鼠左側(cè)子宮腔內(nèi)并用絲線固定于子宮壁，縫合子宮壁切口，逐層關(guān)閉腹腔，縫合背部切口，對(duì)照組植入普通銅材料，實(shí)驗(yàn)組植入超細(xì)晶銅材料；分別于術(shù)后12 h、1 d、3 d、7 d、15 d、30 d各處死5只大鼠。收集大鼠外周血血清，以1 ml生理鹽水灌洗雙側(cè)子宮腔并收集灌洗宮腔液，收集雙側(cè)子宮組織，其中左側(cè)與銅絲螺管接觸區(qū)域及未植入的右側(cè)子宮各取2段(3～4 mm)子宮組織、肝臟組織(0.25～0.40 g)，稱(chēng)重記錄后分別保存于4%多聚甲醛和液氮中備用。

1.4 Cu2+濃度測(cè)定

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)檢測(cè)大鼠血清、宮腔灌洗液、子宮組織、肝臟組織中的Cu2+濃度，檢測(cè)前組織材料需消解的使用濃硝酸和去離子水消解：取全血200 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml雙氧水消解，去離子水定容到3 ml送檢；取宮腔灌洗液300 μl，用1 ml硝酸+0.5 ml雙氧水消解，去離子水定容到3 ml送檢；肝臟組織(0.25～0.4 g)加入3 ml+1.5 ml硝酸消解，去離子水定容到30 ml，取3 ml送檢。委托北京大學(xué)分析測(cè)試中心采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)檢測(cè)Cu2+濃度，并按照樣品初始體積或質(zhì)量換算成單位體積或質(zhì)量濃度。

1.5 組織切片染色

固定于4%多聚甲醛中子宮組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟、水化，蘇木素浸染1～2min后清洗，1%鹽酸酒精分化5～10s，流水沖洗返藍(lán)，伊紅浸染20～30s，常規(guī)梯度脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，普通顯微鏡組織學(xué)觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Cu2+在大鼠血清和肝臟中含量

植入兩種銅材料后，兩組大鼠血清中Cu2+濃度逐漸增加，在植入后3d達(dá)到高峰(P<0.05)，植入7d和15d時(shí)沒(méi)有顯著波動(dòng)，至植入30d顯著下降(P<0.05)接近植入12h時(shí)水平；實(shí)驗(yàn)組植入7d時(shí)血清Cu2+濃度呈下降趨勢(shì)，至植入15d時(shí)低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)肝臟中Cu2+濃度未有明顯波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組植入7d、15d和30d時(shí)Cu2+濃度均低于植入3d時(shí)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組埋置銅絲不同時(shí)間Cu2+濃度比較

2.2 Cu2+在大鼠子宮腔灌洗液中含量

兩組放置銅絲螺管的左側(cè)子宮宮腔灌洗液Cu2+濃度呈相似變化趨勢(shì)，植入12h、1d時(shí)Cu2+濃度無(wú)明顯變化，植入3d時(shí)達(dá)高峰(P<0.05)，植入7d、15d、30d時(shí)逐漸下降，且實(shí)驗(yàn)組植入3d、7d、15d時(shí)低于對(duì)照組(P<0.01。右側(cè)宮腔灌洗液Cu2+濃度低于左側(cè)，且在植入12h、1d、3d時(shí)逐漸升高，至7d后Cu2+濃度趨于穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

表2 兩組埋置銅絲后不同時(shí)間宮腔液中Cu2+濃度比較

2.3 Cu2+在大鼠子宮組織中含量

在植入12h，兩組植入銅絲的左側(cè)子宮組織中Cu2+濃度無(wú)差異，植入1d、3d時(shí)下降，在植入7d、15d時(shí)實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組(P<0.05)。未植入銅材料的右側(cè)子宮組織中Cu2+濃度較左側(cè)低，且在植入7d、15d時(shí)實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組埋置銅絲后子宮組織中Cu2+濃度比較

2.4 子宮組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

組織學(xué)結(jié)果顯示，埋植銅絲1d，對(duì)照組子宮宮腔上皮廣泛脫落，腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞裸露，宮腔內(nèi)可見(jiàn)炎性滲出物及壞死脫落組織，內(nèi)膜中有大量的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，內(nèi)膜無(wú)菌性炎癥反應(yīng)累及范圍廣而深，達(dá)到內(nèi)膜中部，并部分累及到腺體；實(shí)驗(yàn)組子宮雖同樣可見(jiàn)子宮內(nèi)膜腔上皮脫落，腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞裸露以及無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，但炎性反應(yīng)僅局限于內(nèi)膜淺層，并未像對(duì)照組炎癥反應(yīng)已經(jīng)到達(dá)子宮深層。在埋植銅絲7d，兩組子宮組織宮腔上皮仍有部分脫落，腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)部分裸露，炎性反應(yīng)發(fā)生在內(nèi)膜淺層，但對(duì)照組更為明顯。在埋植銅絲30d時(shí)，兩組無(wú)明顯區(qū)別，內(nèi)膜上皮被覆基本完整，內(nèi)膜淺層可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，呈現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同植入組大鼠各時(shí)期子宮組織學(xué)表現(xiàn)

3 討論

盡管臨床實(shí)踐證明含銅IUD具有較理想的避孕效果，但出血、感染、腹痛、腰痛等不良反應(yīng)始終困擾著使用者。Cu2+暴釋是副反應(yīng)產(chǎn)生的重要因素之一，Cu2+暴釋與銅材料的腐蝕行為密切相關(guān)[6]，而塊體銅材料不同的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)是造成腐蝕行為差異的原因。普通純銅材料內(nèi)部的晶粒平均尺寸為40μm，表面晶界密度較低；而本研究實(shí)驗(yàn)組采用的新型超細(xì)晶銅材料的平均晶粒尺寸僅為0.3 μm，表面晶界密度和缺陷密度大幅增加，高密度晶界可以降低銅在模擬體液中的腐蝕速率。體外研究也顯示了超細(xì)晶銅材料具備完全可接受的Cu2+釋放行為以及更好的生物相容性[4]。

本研究中植入不同銅材料的兩組大鼠外周血和肝臟組織中Cu2+濃度變化趨勢(shì)未見(jiàn)差異，提示超細(xì)晶銅材料植入大鼠宮腔后釋放的Cu2+對(duì)機(jī)體系統(tǒng)性影響與普通銅材料相似。同時(shí)，宮腔灌洗液中的Cu2+濃度兩種銅材料在植入3d時(shí)達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，但超細(xì)晶銅材料組下降更明顯且低于普通銅材料組，提示兩種銅材料的早期爆釋峰值時(shí)間相似，但超細(xì)晶銅材料的Cu2+爆釋持續(xù)時(shí)間更短，爆釋量更低。

大鼠植入側(cè)子宮組織中Cu2+濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，盡管在兩種銅材料植入后前3天沒(méi)有差異，但在7d和15d時(shí)超細(xì)晶銅材料組降低明顯，植入30d時(shí)兩種含量相似。組織學(xué)觀察，在兩種銅材料植入后早期兩組子宮內(nèi)膜均經(jīng)歷急性炎性損傷，超細(xì)晶銅材料組在植入7d時(shí)內(nèi)膜組織表現(xiàn)出更好的組織修復(fù)，至植入30d兩組組織學(xué)相似，呈慢性炎癥改變。提示超細(xì)晶銅材料可能有利于減少子宮出血包括出血量和出血時(shí)間。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外為解決含銅IUD的不良反應(yīng)開(kāi)展了多方面研究工作，如減少銅的暴露面積，采用銅管或鋼絲套管包繞銅線[7]。蔡水洲等研究出納米銅與低密度聚乙烯的新型納米復(fù)合材料來(lái)改善Cu2+暴釋現(xiàn)象，提高銅離子利用率[8]。Li Juan等提出了一種銅鹽與二氧化硅和聚乙烯醇的新型復(fù)合材料，消除了植入初期的暴釋[9]。由于這些研究引入了新元素或新材料，也有許多未知問(wèn)題需要深入研究解決。新型超細(xì)晶銅材料制備工藝主要是通過(guò)多道次擠壓工藝改變材料晶格尺度[10]，并沒(méi)有引入新的元素或材料。本研究結(jié)果提示與傳統(tǒng)普通銅材料相比，可以降低早期Cu2+釋放峰值，縮短爆釋時(shí)間，有效緩解了Cu2+暴釋問(wèn)題，進(jìn)而減少和緩解由于Cu2+暴釋引起的子宮損傷等不良反應(yīng)。有望能替代現(xiàn)有含銅IUD中的普通銅材料，以減少臨床應(yīng)用中含銅IUD出血等不良反應(yīng)。