張萃萍，歐陽曉春

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330002)

急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)是指在急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning，ACMP)后，經(jīng)過2～60 d的“假愈期”后部分患者再次出現(xiàn)一組以錐體系及錐體外系表現(xiàn)及癡呆等精神癥狀為主的腦功能障礙，給患者的家庭及社會造成很大負擔，且DEACMP的發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無明確的結(jié)論。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，血清免疫因子參與DEACMP的發(fā)病，本研究通過檢測血漿干擾素-γ(IFN-γ)的水平及IFN-γ基因+874位點單核苷酸多態(tài)性，探討IFN-γ水平及其基因多態(tài)性與DEACMP的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

病例來自中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2016年2月至2019年2月收治的住院病例，均符合ACMP及DEACMP的診斷標準[2]。DEACMP患者30例(DEACMP組)，男16例，女14例，年齡13～74歲，平均年齡(42.6±12.2)歲，平均住院(20.5±4.5)d，昏迷持續(xù)時間為2～26 h，平均(8.4±4.3)h。ACMP后未發(fā)生遲發(fā)性腦病患者30例(ACMP組)，男17例，女13例；年齡11～78歲，平均(43.5±11.8)歲；昏迷持續(xù)時間為1～23 h，平均(8.1±4.1)h；其中毒方式及時間與DEACMP組相似。2組年齡、性別、昏迷時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

排除標準：1)接受過免疫抑制劑治療;2)既往有糖尿病、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、營養(yǎng)不良及精神疾?。?)近期有嚴重感染史；4)妊娠、哺乳及月經(jīng)期婦女。

1.2 干擾素-γ+874基因多態(tài)性檢測

1.2.1 引物設(shè)計與合成

從GENBANK下載人IFN-γ基因序列，應(yīng)用Primer 5.0，針對+874 T→A多態(tài)性位點，由華大基因合成引物,序列如下：

IIFN-γ基因+874T→A(527 bp)

上游1：5′-TAT TCT TAC AAC ACA AAA TCA AAT CT -3′

上游2：5′-TAT TCT TAC AAC ACA AA A TCA AAT CA-3′

下游：5′-TTA TCC GCT ACA TCT GAA TGA C -3′

GAPDH引物序列(158 bp)

上游：5′-GTC AAG GCT GAG AAC GGG AA-3′

下游：5′-AAA TGA GCC CCA GCC TTC TC-3′

1.2.2 DNA提取

取ETDA抗凝靜脈血2 mL，在-20 ℃條件下凍存，采用北京天根基因組提取試劑盒提取DNA,按說明進行。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)條件

PCR擴增體系為25 μL，包括:2XTaq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板:2 μL，雙蒸水加至25 μL。擴增條件:95 ℃預(yù)變性4 min后進入循環(huán)擴增,即先94 ℃變性30 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,重復(fù)10個循環(huán)后,再進入第2次循環(huán),即:94 ℃變性30 s,50 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,重復(fù)23個循環(huán)后于72 ℃再延伸6 min。2%瓊脂糖4.0 g·dL-1溴乙錠凝膠方法電泳(120 V 20 min),紫外透射自動成像分析儀成像。

1.3 IFN-γ水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿細胞因子IFN-γ水平。用EDTA抗凝管收集患者外周靜脈血2～3 mL，離心后取0.5～1.0 mL，-20 ℃冰箱中保存。ELISA試劑盒采用上海森雄科技實業(yè)有限公司，按使用說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ+874位點多態(tài)性檢測

IFN-γ+874 T→A多態(tài)性位點PCR擴增目的片段均為527 bp,此位點存在TT、TA、AA 3個基因型,GAPDH內(nèi)參產(chǎn)物片段為158 bp。每兩個孔道組成一個基因型，1/2泳道為雜合型TA型,3/4泳道為純合TT型，5/6泳道為純合AA型，7/8泳道為純合TT型，見圖1。

2.2 基因型頻率分型

2組IFN-γ+874 T→A位點的平衡定律檢驗顯示，IFN-γ+874 T→A位點TA、TT、AA 3個基因型組成T、A 2個等位基因，頻率均符合遺傳平衡法則(P>0.05)，見表1。

2.3 2組IFN-γ+874基因型及等位基因頻率

DEACMP組IFN-γ+874位點TA、TT、AA基因型與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DEACMP組T、A等位基因頻率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.4 2組血漿IFN-γ水平

DEACMP組血漿IFN-γ為(29.20±9.37)ng·L-1，ACMP組為(18.58±8.42)ng·L-1，DEACMP組血漿IFN-γ水平明顯高于ACMP組(t=4.62,P<0.01)。

3 討論

ACMP可造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害為主的全身各組織細胞的損傷，在一氧化碳中毒患者中有較高的發(fā)病率，國外研究報道本病近10年發(fā)病率為20%～60%；國內(nèi)發(fā)病率為0.2%～47.3%，重度ACMP患者可達10%～40%[3]。對患者的身體健康以及生命造成極為嚴重的影響，DEACMP可能的發(fā)病機制有缺血缺氧、自由基損傷、細胞毒性損傷、NO介導(dǎo)的損傷、細胞凋亡、內(nèi)源性CO損傷等[4]，不過上述學(xué)說均不能很好地解釋DEACMP的病理改變及臨床表現(xiàn)，提示DEACMP的發(fā)病過程中可能還有其他機制共同參與其中。有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，對DEACMP患者多種血清免疫因子均出現(xiàn)明顯變化，提示神經(jīng)免疫因素參與了DEACMP的發(fā)病，IFN-γ來源于活化的單核巨噬細胞，可增強T細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞的活力而對機體起免疫調(diào)節(jié)作用，對細胞免疫應(yīng)答和抗原呈遞均有增強作用，本研究結(jié)果顯示，DEACMP組血清IFN-γ水平明顯高于ACMP組，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示DEACMP患者急性期血清IFN-γ水平明顯增高，可能是影響遲發(fā)性腦病發(fā)生的危險因素，對于判定病情和評估預(yù)后具有一定的臨床意義，但沒有監(jiān)測其在疾病發(fā)展過程的動態(tài)變化，其在遲發(fā)性腦病中如何發(fā)揮的作用尚不明確。

劉勇林等[7]研究表明，暴露時間和中毒后昏迷時間是DEACMP的發(fā)生的危險因素，但年齡、性別、暴露時間和中毒后昏迷時間相似的患者其預(yù)后有時也存在天壤之別，提示存在個體間的差異，推測可能受某些內(nèi)在相關(guān)基因的影響。LI等[8]研究證實，在NRXN3基因中發(fā)現(xiàn)了DEACMP和特異性SNPs之間的相關(guān)性，提示DEACMP具有遺傳易感性，DEACMP是環(huán)境因素與個體遺傳背景相互作用的結(jié)果，但這方面研究極少，有待于發(fā)現(xiàn)更多可能存在的相關(guān)基因。不少缺氧性疾病與自身免疫損傷和髓鞘結(jié)構(gòu)破壞存在關(guān)聯(lián)[9-10]，而DEACMP頭顱磁共振及病理特點提示腦白質(zhì)的脫髓鞘改變，DEACMP與多發(fā)性硬化相類似，兩者屬于繼發(fā)性脫髓鞘疾病，病理改變及臨床表現(xiàn)具有諸多相似，此類疾病發(fā)病多集中在自身免疫損傷和髓鞘結(jié)構(gòu)破壞環(huán)節(jié)，具有遺傳易患性[11]。王慧詞等[12]通過對MS基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化易感性相關(guān)，故本實驗選取年齡、性別、昏迷時間等基本條件無明顯差別的DEACMP組及未發(fā)生DEACMP的ACMP組病例進行研究，結(jié)果表明，DEACMP組IFN-γ+874位點AA、AT、TT基因型數(shù)量分別為20、7、3，對應(yīng)的ACMP組分別為18、10、2，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DEACMP組A、T等位基因頻率分別為43、17，ACMP組分別為39、21，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示IFN-γ+874基因多態(tài)性與DEACMP的遺傳易感性之間沒有相關(guān)性。

本研究中，DEACMP組與ACMP組IFN-γ+874位點AA、AT和TT基因分布無差異，提示IFN-γ基因多態(tài)性與DEACMP的發(fā)病無明顯相關(guān)，在血液檢測指標中，DEACMP患者IFN-γ明顯高于ACMP組，說明一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的發(fā)生與神經(jīng)免疫損傷機制有關(guān)。目前認為IFN-γ+874A/T基因多態(tài)性不能作為DEACMP的預(yù)警指標，由于樣本量較少,又存在地域和種族之間的差異,結(jié)果還有待進一步研究。