李 艷，張 錦，閆麗明

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，陜西 延安 716000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致女性死亡的第四大癌癥，每年在中國(guó)約有27.5萬人死于宮頸癌[1]。宮頸癌發(fā)病率高于其他婦科腫瘤類疾病，每年約有100萬新發(fā)病例[2]。目前宮頸癌患者的治療策略主要依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)和手術(shù)病理分期、腫瘤分級(jí)，不足以反映宮頸癌在疾病中的異質(zhì)性。雖然已經(jīng)有很多識(shí)別宮頸癌新的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物可以改善治療的效果，但臨床晚期的患者仍然面臨著高死亡率和預(yù)后不良的現(xiàn)象。因此，還要尋找更可靠的臨床病理和分子預(yù)后標(biāo)志物，來完善個(gè)性化治療策略。評(píng)估腫瘤的遷移、患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)是非常重要的，微小RNA(miRNA)是一種進(jìn)化上十分保守的核苷酸的小分子，基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育和死亡等所有生物過程。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)是癌癥的主要標(biāo)志之一。 miR-9、miR-192和miR-205異常表達(dá)，在卵巢癌、直腸癌等腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著主要作用。但目前miR-9，miR-192和miR-205在宮頸癌生物學(xué)作用研究較少，因此，本研究通過比較宮頸癌患者與健康者血清miR-9、miR-192和miR-205水平，分析宮頸癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平與臨床病理的關(guān)系，探討miR-9、miR-192和miR-205診斷宮頸癌的臨床價(jià)值，為宮頸癌的下一步有效治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月至2019年7月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院接受治療的宮頸癌患者78例為觀察組，選取同期在本院體檢健康者30例為對(duì)照組，年齡29～46歲。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):1)HPV感染檢測(cè)HPV16/18確診為陽性；2)經(jīng)病理診斷為宮頸癌患者；3)入醫(yī)前未經(jīng)過放療或者化療治療的患者；4)病理資料完整；5)沒有婦科內(nèi)分泌疾病和其他婦科腫瘤疾病的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):1)年齡大于70歲的患者；2)合并其他惡性腫瘤和心肺等臟器功能不全的患者；3)存在免疫功能障礙的患者；4)合并其他慢性感染性疾病的患者。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 主要試劑和儀器

Trizol試劑盒購自于invitrogen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于上海生工生物工程有限公司，臺(tái)式離心機(jī)購自于Beckman公司產(chǎn)品，定量PCR儀購自于美國(guó)ABI公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)采集與處理

采集標(biāo)本1 h后用Ficoll提取液提取6 mL血清，再放入1 mL的Trizol的裂解液裂解細(xì)胞。

1.2.3 血清中的Total RNA的提取

血清和Trizol液體各2 mL放入離心管中，充分混勻振蕩，進(jìn)行裂解后提取Total RNA，在加入Rnasin后放于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2.4 RT-qPCR反應(yīng)檢測(cè)

使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL,莖環(huán)引物為2 μL,Total RNA為2 μL，然后加入ddH2O到20 μL，混勻，放到擴(kuò)增儀上，15 ℃ 15 min,40 ℃ 20 min,80 ℃ 15 min反應(yīng)，合成cDNA放于-80 ℃的冰箱中保存。在使用MGB探針，以U6作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為10 μL,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，正向引物序列為2 μL，反向引物序列2 μL，MGB探針2 μL，cDNA為2 μL，在加入ddH2O到30 μL，PCR反應(yīng)條件:90 ℃ 2 min,80 ℃ 20 s,45 ℃ 15 s,共計(jì)45個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，對(duì)miR-9，miR-192和miR-205進(jìn)行歸一化處理，采用相對(duì)定量法，表達(dá)倍數(shù)的變化用F=2-△△Ct公式計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-9、miR-192和miR-205在宮頸癌中的表達(dá)

觀察組血清miR-9、miR-205水平顯著高于對(duì)照組，miR-192水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組血清miR-9、miR-192和miR-205水平比較

2.2 宮頸癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平與臨床病理的關(guān)系

miR-9、miR-192和miR-205與腫瘤的TNM分期、分化程度具有相關(guān)性(P<0.05)，miR-9、miR-205與腫瘤的組織類型具有相關(guān)性(P<0.05)，miR-9、miR-192與腫瘤的淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者血清miR-9、miR-192和miR-205水平與臨床病理的關(guān)系

2.3 miR-9、miR-192和miR-205表達(dá)的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-9、miR-192和miR-205診斷宮頸癌的AUC值分別為0.829(SE為0.082，95%CI為0.652～0.969)、0.784(SE為0.085，95%CI為0.627～0.949)和0.712(SE為0.092，95%CI為0.547～0.922)。miR-9、 miR-192和miR-205檢測(cè)宮頸癌的敏感度分別為80.93%、78.23%和69.82%，特異度分別為77.03%、79.35%和81.14%。見圖1。

3 討論

宮頸癌是一種常見的女性癌癥，每年都會(huì)有26萬人死于該疾病。基于該組織或者血清中分子水平的預(yù)后標(biāo)志物的開發(fā)，有助于個(gè)體化的治療和病情的改善，有助于延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間甚至達(dá)到治愈的效果。最近研究[3]發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-192和miR-205在許多腫瘤組織和細(xì)胞中均表達(dá)異常，miR-9在喉鱗癌組織、卵巢癌等組織中表達(dá)會(huì)升高，miR-192結(jié)直腸癌組織、卵巢癌等組織中異常低表達(dá)，miR-205在子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤中出現(xiàn)異常高表達(dá)，這就意味著miR-9、miR-192和miR-205異常表達(dá)和各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著高度的相關(guān)性。

miRNA是在進(jìn)化中的單鏈非編碼RNA，是通過靶基因蛋白調(diào)節(jié)的表達(dá)調(diào)控生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)650多個(gè)miRNA與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，在不同的腫瘤中表達(dá)有些類似，有些miRNA可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，有些miRNA可以抑制腫瘤的發(fā)生。本文研究結(jié)果表明，宮頸癌患者的miR-9和miR-205水平顯著高于健康者，宮頸癌患者的miR-192水平顯著低于健康者，這就意味著miR-9和miR-205在宮頸癌中異常高表達(dá)，miR-192在宮頸癌中異常低表達(dá)。PARK等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-9在人類的多種癌癥中都出現(xiàn)異常表達(dá)；也有研究[5]證明，miR-9促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和增殖，對(duì)下游基因的表達(dá)具有調(diào)控作用；李小燕等[6]研究證明miR-9通過調(diào)控不同的靶向基因mRNA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移具有重要的作用。目前，miR-205在宮頸癌中相關(guān)報(bào)道較少，仍有許多問題尚需要探討，LU等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-205具有調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖的能力，對(duì)細(xì)胞周期也有一定的影響，也有相關(guān)研究[8]報(bào)道，在HPV為陽性的宮頸癌中，miR-205的表達(dá)較正常組織明顯上升，YU 等[9]研究表明，在宮頸癌細(xì)胞分離過程中miR-205 的含量表達(dá)比較豐富，在HPV18+Hela細(xì)胞外，宮頸癌組織中miR-205表達(dá)有所增長(zhǎng)。宋偉國(guó)等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-192在胃癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等多種癌癥中表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。也有相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道m(xù)iR-192在結(jié)腸癌組織中明顯下調(diào)，因此說明miR-192和癌癥的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系也比較密切。

上述研究只說明miR-9、miR-192和miR-205在癌癥中的表達(dá)，并未說明在癌中的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性，本研究對(duì)宮頸癌患者miR-9、miR-192和miR-205水平與臨床病理的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miR-9、miR-192和miR-205與年齡、腫瘤大小沒有相關(guān)性,miR-192與組織學(xué)上劃分沒有相關(guān)性,miR-205和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性；miR-9、miR-192和miR-205與TNM分期和腫瘤的分化的程度具有相關(guān)性，miR-9、miR-205與組織學(xué)上劃分具有相關(guān)性，miR-9、miR-192與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-9、 miR-192和miR-205檢測(cè)宮頸癌的敏感度分別為80.93%、78.23%和69.82%，特異度分別為77.03%、79.35%和81.14%。上述結(jié)果證明，miR-9、miR-192和miR-205與癌癥的發(fā)生和發(fā)展具有相關(guān)性。

XIN等[12]研究證明miR-9甲基化能夠促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，能夠促進(jìn)子宮癌細(xì)胞的增殖和遷移，但在卵巢癌和胃癌中能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明miR-9即是促癌因子，又是抑制癌癥發(fā)展的因子[13]。本研究結(jié)果顯示miR-9是促癌因子，和癌癥的分期、腫瘤的分化和淋巴的轉(zhuǎn)移程度具有一定的相關(guān)性。董立新等[14]報(bào)道，miR-192能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、周期和凋亡的作用，可用來輔助臨床腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等診斷，miR-192的下調(diào)與乳腺癌、腎癌、肝癌等發(fā)生關(guān)系密切；在食管癌中可抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用；miR-192在不同腫瘤的發(fā)展中作用不同。miR-205在婦科疾病中研究比較廣泛，一般集中在子宮內(nèi)膜癌的領(lǐng)域，在宮頸癌和卵巢癌中的相關(guān)報(bào)道較少，LI等[15]研究表明，miR-205子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)；也有研究[16]報(bào)道，miR-205在卵巢內(nèi)膜樣癌組織中表達(dá)明顯較正常者增多，和卵巢癌的發(fā)生具有一定的相關(guān)性；SONG 等[17]報(bào)道，miR-205水平與乳腺癌的臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系密切，可作為獨(dú)立的預(yù)后因子，對(duì)乳腺癌預(yù)測(cè)價(jià)值較高，與本文研究結(jié)果具有相似性。

綜合上述，宮頸癌患者中miR-9和miR-205呈現(xiàn)高表達(dá)，miR-192呈現(xiàn)低表達(dá)，和宮頸癌的臨床病理學(xué)關(guān)系密切，對(duì)宮頸癌的診斷具有一定的參考價(jià)值，但由于本文研究樣本量有限，是否作為臨床診斷的獨(dú)立預(yù)后因子，還有待于進(jìn)一步研究。