李云云，周學亮

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心臟外科，南昌 330006)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)會導致心肌細胞永久性喪失，瘢痕組織形成，從而導致心力衰竭發(fā)生，是全世界死亡和殘疾的主要原因之一[1-2]。心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)主要是通過轉化為活化的肌成纖維細胞(cardiac fibroblast-myofibroblast transformation,CMT)參與心肌纖維化，表現(xiàn)為波形蛋白(Vimentin)表達的降低、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達的升高，在MI后重塑中起關鍵作用[3-4]。

Notch信號通路由Notch受體和配體等構成，兩者結合后，Notch發(fā)生二次裂解，釋放胞內結構域(notch intracellular domain,NICD)進入細胞核，與轉錄因子RBP-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin Jκ)結合，啟動Hes、HRT等靶基因轉錄，可抑制α-SMA的表達，從而抑制CMT的發(fā)展，間接抑制MI后的心臟纖維化[3,5]。WANG等[6-9]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中，miRNA發(fā)揮了至關重要的作用：miR-155可以抑制MI后的CFs增殖，miR-29b的過表達可以顯著減少MI后的瘢痕形成，促進MI后心功能恢復等；miR-29b抑制MI后心肌纖維化，是通過Notch信號通路介導的；同樣，miR-199b-5p促進MI后心肌纖維化，也是通過影響Notch信號通路等介導的。這些都提示，部分miRNA可能通過Notch信號通路，調節(jié)MI后的心肌纖維化。因此，本研究將基于Notch信號通路篩選特異性調控心肌纖維化的miRNA，為逆轉心肌纖維化提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

TGF-β1購自Sigma(美國)，DAPT購自Selleck(中國)，miRNA抑制劑、miRNA引物購自Ribobio(中國)，Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基購自GE Biotechnology(美國)，胰蛋白酶-EDTA溶液、FBS、Trizol、逆轉錄酶、SYBR Premix購自Thermo Fisher(美國)，Oligo-dT引物購自上海捷瑞生物工程有限公司(中國)，CCK-8 Assay購自Dojindo(日本)，miRNAs快速檢測試劑盒購自漢恒生物(中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代大鼠CFs分離培養(yǎng)

無菌條件下取新生SD大鼠(出生1～3 d)心臟，0.05%胰蛋白酶分離原代大鼠CFs，采用差速貼壁法提取CFs。將CFs放入10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待CFs生長近融合狀態(tài)時以1:2傳代。本研究中用第2—3代CFs。

1.2.2 CMT誘導

按“1.2.1”方法分離培養(yǎng)CFs，細胞生長至70%融合度時，無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，使用10 ng·mL-1轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Notch信號通路抑制

按“1.2.1”方法分離培養(yǎng)CFs，細胞生長至70%融合度時，無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，使用10 ng·mL-1TGF-β1+10 μmol·L-1γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，DAPT)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.4 篩選miRNA

按“1.2.1”方法分離培養(yǎng)CFs，細胞生長至70%融合度時，無血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，將CFs被分為3組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(sham組)、含10 ng·mL-1TGF-β1的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(TGF組)；含10 ng·mL-1TGF-β1+10 μmol·L-1DAPT的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h(TGF+DAPT組)。通過miRNAs快速檢測試劑盒(MirQEasy)檢測miRNA的表達，以U6基因表達量作為內參，篩選差異表達的miRNA。

1.2.5 miRNA表達抑制

設計miR-21、miR-23、miR-140反向序列抑制劑，按“1.2.1”方法分離培養(yǎng)CFs，細胞生長至70%融合度時，在含100 pmol·L-1miRNAs抑制劑的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，加入10 ng·mL-1TGF-β1培養(yǎng)相應時間。

1.2.6 細胞增殖測定

按“1.2.1”方法分離培養(yǎng)CFs，細胞生長至70%融合度時，在96孔培養(yǎng)板中，將CFs以2×103個·孔-1的密度接種(含10%胎牛血清培養(yǎng)基)，并在37 ℃的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后按說明書采用CCK-8 Assay檢測CFs活細胞：將CCK-8溶液加入到96孔板中的細胞中，并將板在37 ℃下孵育4 h，并使用酶標儀在450 nm下讀取每個孔的光密度。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測

使用Trizol從CFs中提取總RNA。使用Thermo NanoDrop 2000測定RNA濃度和純度。使用1 μg總RNA、逆轉錄酶和Oligo-dT引物合成cDNA。使用SYBR Premix和以下引物進行實時熒光定量PCR檢測：Vimentin引物序列5′ATATATGAGTCCCTGGAGCG 3′和5′AGGTGGCGATCTCAATGTCA 3′，α-SMA引物序列5′GCTATTCAGGCTGTGCTGTC 3′和5′GGTAGTCGGTGAGATCTCGG 3′，GAPDH引物序列5′AGTCTACTGGCGTCTTCACC 3′和5′CCACGATGCCAAAGTTGTCA 3′，U6引物序列5′CGCTTCGGCACATATACTA 3′和5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA 3′。PCR在Applied Biosystems 7900 QPCR系統(tǒng)上進行，循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min，1個循環(huán);95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，并用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析。單因素方差分析對照組和處理組之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 調控心肌纖維化的Notch信號相關miRNA

為了篩選相關miRNA，本研究首先以TGF-β1誘導大鼠CFs發(fā)生CMT，期間利用DAPT抑制Notch信號通路。結果顯示，TGF-β1誘導前后，有16個miRNA表達明顯上調：miR-21(RQ=8.32，P<0.000 1)、miR-23b(RQ=2.73，P<0.000 1)、miR-140(RQ=1.60，P<0.05)、miR-27b(RQ=4.52，P<0.001)、miR-99b(RQ=3.95，P<0.001)、miR-103(RQ=3.50，P<0.01)、miR-199-3p(RQ=4.92，P<0.000 1)、miR-223(RQ=6.04，P<0.000 1)、miR-224(RQ=7.80，P<0.000 1)、miR-532-5p(RQ=4.27，P<0.01)、rno-miR-224(RQ=3.22，P<0.000 1)、miR-450(RQ=5.30，P<0.000 1)、miR-155(RQ=2.43，P<0.05)、miR-314(RQ=3.96，P<0.000 1)、miR-652(RQ=4.80，P<0.000 1)、miR-31(RQ=5.60，P<0.000 1)。在TGF-β1誘導基礎上加入DAPT后，發(fā)現(xiàn)15個miRNA表達差異明顯，其中上調2個：miR-31(RQ=1.64，P<0.01)、miR-314(RQ=2.27，P<0.000 1)；下調13個：miR-21(RQ=0.21，P<0.000 1)、miR-23b(RQ=0.38，P<0.000 1)、miR-27b(RQ=0.28，P<0.001)、miR-99b(RQ=0.31，P<0.000 1)、miR-103(RQ=0.33，P<0.001)、miR-199-3p(RQ=0.40，P<0.000 1)、miR-223(RQ=0.23，P<0.000 1)、miR-224(RQ=0.29，P<0.000 1)，miR-497(RQ=0.67，P<0.05)，miR-532-5p(RQ=0.28，P<0.01)、rno-mir-224(RQ=0.42，P<0.000 1)、miR-450(RQ=0.27，P<0.000 1)、miR-652(RQ=0.38，P<0.000 1)。見圖1。結果表明，基于Notch信號通路，miR-31、miR-314、miR-21、miR-23b、miR-27b、miR-99b、miR-103、miR-199-3p、miR-223、miR-224,miR-532-5p、rno-mir-224、miR-450、miR-652可能調控心肌纖維化。

2.2 miR-21、miR-23b促進大鼠CFs增殖和CMT發(fā)展

miR-21、miR-23b、miR-140抑制劑加入大鼠CFs，CCK-8檢測結果顯示，miR-21、miR-23b抑制劑可明顯抑制CFs的增殖(均P<0.05)，而miR-140抑制劑對CFs增殖無明顯影響(P>0.05)(圖2A)。PCR檢測結果顯示，miR-21、miR-23b抑制劑可明顯提高Vimentin表達(RQ=2.52、1.86，均P<0.001)，降低α-SMA表達(RQ=0.50、0.74，均P<0.001)，而miR-140抑制劑對Vimentin、α-SMA表達無明顯影響(RQ=1.00、1.11，均P>0.05)(圖2B)。表明miR-21、miR-23b促進CFs增殖和CMT發(fā)展。

3 討論

MI后過度纖維化極易誘發(fā)包括心力衰竭在內的嚴重心臟病[10]。而CMT是心肌纖維化的始發(fā)事件。最新研究[5]表明，Notch信號通路抑制CMT，限制心肌纖維化發(fā)展。因此，基于Notch信號通路，篩選調控心肌纖維化的關鍵分子對相關心臟病的預防與治療有著重要的意義。

而BAYOUMI等[11-13]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中，大量miRNA扮演著重要的角色，其中，miR-29b、miR-199b-5p調控心肌纖維化的發(fā)展是通過Notch信號通路介導的[8-9]，提示部分miRNA可能是基于Notch信號通路調控心肌纖維化的關鍵分子。因此，本研究旨在基于Notch信號通路，篩選特異性調控心肌纖維化的miRNA。首先通過抑制Notch信號通路，找出調控心肌纖維化的可能miRNA，其次，在這些miRNA中，去證明miR-21、miR-23b促進心肌纖維化的發(fā)展。

在本研究中，鑒于TGF-β1在心肌纖維化中的關鍵作用，首先利用TGF-β1，篩選出16個可能調控心肌纖維化的miRNA；其次，利用DAPT抑制Notch信號通路，篩選出了基于Notch信號通路，14個可能調控心肌纖維化的miRNA，其中上調2個，下調12個。之后，筆者想驗證基于Notch信號通路，部分可能調控心肌纖維化的miRNA是否特異性調控心肌纖維化，因此，筆者結合查閱的文獻[14-16]，進行了miR-21、miR-23b、miR-140在CFs增殖和CMT中的作用研究。結果表明，miR-21、miR-23b抑制劑可明顯抑制CFs增殖，且提高CFs標志物Vimentin表達，降低肌成纖維細胞標志物α-SMA表達。換句話說，miR-21、miR-23b促進大鼠CFs增殖和CMT發(fā)展?？傊?，基于Notch信號通路，本研究篩選出了特異性調控心肌纖維化的miR-21、miR-23b。

盡管有大量的研究[17-19]證明，miRNA可以作用于Notch信號通路，但大部分都是介導心肌保護與損傷的研究，如miR-363通過Notch信號傳導，調節(jié)缺氧誘導的心肌細胞凋亡；miR-208a通過Notch/NF-κB信號通路，調節(jié)缺血再灌注中的心肌細胞損傷；miR-449a調節(jié)缺氧/復氧性細胞損傷是通過Notch1信號通路介導的。然而，卻很少有miRNA通過Notch信號通路調節(jié)心肌纖維化的研究。因此，本研究基于Notch信號通路，篩選出了特異性調控心肌纖維化的miR-21、miR-23b。這為進一步研究miRNA與Notch信號通路在調控心肌纖維化中的關系奠定了基礎，并為基于miRNA調控，開發(fā)逆轉心肌纖維化的藥物提供了基礎信息。然而，miR-21、miR-23b調控心肌纖維化的具體機制有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。