段元彬，劉小林*，江中良，張慧林，陳 強

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西咸陽 712100；2.陜西安大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，陜西渭南 714300）

在人工授精前，通常需要用不同稀釋液對精液進行一定比例的稀釋。Lake等[1]通過對雞精液的成分分析，首次配制了一種雞的精液稀釋液（Lake氏液）。谷氨酸鈉對精子的保護作用也被證實，檸檬酸鈉和檸檬酸鉀同樣能夠延長精子保存時間[2]。楊保田等[3]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉溶液能有效提高雞精子的生存指數(shù)。糖（葡萄糖、果糖）等能源物質(zhì)是精子在體外保存不可缺少的部分。蘇東頓等[4]研究證明果糖能提高精液的受精力。黃仁術(shù)[5]試驗證明果糖保存精液的效果優(yōu)于葡糖糖和蔗糖。

番鴨作為優(yōu)良的瘦肉型鴨，具有生長迅速、耐粗飼、產(chǎn)肝性能好等特點[6-7]?，F(xiàn)代化番鴨養(yǎng)殖基地普遍采用人工授精結(jié)合籠養(yǎng)的飼養(yǎng)管理方式。人工授精在雞上的研究比較成熟，但在番鴨精液稀釋液配方上的進展較少[8]，生理鹽水仍然是許多番鴨養(yǎng)殖企業(yè)的常用稀釋液，但其受精率低下；同時生產(chǎn)實踐中也常出現(xiàn)因精液采集過量而造成浪費。本實驗旨在研究常溫下不同稀釋液和稀釋比例對番鴨精子活率的影響，確定最佳稀釋液和稀釋比例，從而為番鴨人工授精技術(shù)提供指導(dǎo)，為番鴨人工授精前精液稀釋提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選擇陜西省渭南市潼關(guān)縣留果安大番鴨養(yǎng)殖基地的40周齡黑羽公番鴨8羽和1 080羽產(chǎn)蛋期黑羽母番鴨。實驗公鴨按飼養(yǎng)管理規(guī)程自由采食飲水，實驗前進行為期1周的采精訓練，每隔1 d采精1次。

1.2 試劑和儀器 葡萄糖、果糖、超純水、青霉素、鏈霉素等所有化學藥品均來自Solarbio。實驗儀器包括顯微鏡、恒溫箱、水浴鍋、移液槍、采精杯、集精杯、1 mL注射器、容量瓶、計數(shù)器以及血細胞計數(shù)板等。

1.3 稀釋液配制 按配方配制NO-1稀釋液、NO-2稀釋液和BJJX稀釋液作為精液稀釋液，以生理鹽水作為對照，滅菌冷卻4℃冷藏備用。稀釋液成分見表1。

表1 稀釋液主要成分

1.4 精液采集 用于實驗的種公番鴨在采精前剪掉泄殖腔周圍的羽毛，以免影響采精，于早09:30左右采精。采用按摩和母鴨誘情結(jié)合法采集8羽40周齡的黑羽公番鴨精液，待種公番鴨勃起有射精反應(yīng)時，左手持采精杯，用右手按壓種公番鴨生殖器外的泄殖腔收集精液，同時注意防止血液、羽毛或糞便混入精液，隔天采集1次。

1.5 精液鑒定與處理 用標準方法測定每次采集精液的精子濃度和運動能力。選用優(yōu)質(zhì)精液（珍珠白，無泄殖腔產(chǎn)物污染，體積大于0.2 mL，精子活率大于0.7，精子濃度大于1×109精子/mL）。將精液分成4等份，用NO-1稀釋液、NO-2稀釋液、BJJX稀釋液和生理鹽水按精液∶稀釋液體積比1:1、1:2、2:1（v/v）分別稀釋于2 mL無菌離心管中，17℃恒溫箱恒溫保存。每隔8 h對各組精子活率進行測定，直至精子全部死亡為止。本實驗共持續(xù)2個月。

1.6 精子活率的評估 采用標準主觀評分法評估精子運動能力。將稀釋至2×108/mL精子濃度的1滴精液，滴加在預(yù)熱至37℃的載玻片和蓋玻片之間，并在400×顯微鏡下觀察。計量視野中前進運動精子的比例，至少統(tǒng)計200個精子。所有的觀察分析都由同一個人完成。

1.7 精子質(zhì)膜完整性的評估 采用低滲腫脹試驗評估質(zhì)膜完整性，質(zhì)膜完整精子表現(xiàn)為尾部彎曲或腫脹。低滲溶液為檸檬酸鈉0.735 g、果糖1.35 g、蒸餾水100 mL[9]。取10 μL稀釋精液和1 mL低滲溶液于離心管中，37℃孵育30 min，并在400×顯微鏡下觀察。每個載玻片至少觀察到200個精子，計數(shù)尾部彎曲腫脹精子數(shù)比例。實驗重復(fù)3次。

1.8 人工授精 將采集自經(jīng)過選育的8羽優(yōu)良黑羽公番鴨的新鮮精液混合，分成4個等份；以NO-1、N0-2、BJJX、生理鹽水分別以精液:稀釋液體積比1:1稀釋，以生理鹽水為對照組，稀釋后馬上輸精。對同一批1 080只40周齡黑羽產(chǎn)蛋母番鴨進行人工授精，于撿蛋后10:00左右輸精，每5 d輸精1次，每次輸精0.1 mL，單次采精輸精在1 h內(nèi)完成。授精后第2天收集合格種蛋。統(tǒng)計4組受精率并分析其差異，人工授精實驗共持續(xù)3月左右。

1.9 統(tǒng)計分析 用Excel 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。用ANOVA和Tukey's進行差異顯著性檢驗。所得結(jié)果以平均值±標準差表示，所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同稀釋比例的稀釋液對精子活率的影響 經(jīng)測定，新鮮精液精子活率0.91。如表2所示，所有稀釋液組的精子活率都隨著保存時間的延長而明顯下降。稀釋比例為1:1時，NO-1、NO-2、BJJX組精子活率于24 h出現(xiàn)明顯下降，對照組于16 h后出現(xiàn)顯著下降；稀釋比例為1:2時，NO-1、BJJX組精子活率于24 h出現(xiàn)明顯下降，2組在8 h，對照組于16 h后出現(xiàn)顯著下降；稀釋比例為2:1時，NO-1、NO-2、BJJX、對照組精子活率于16 h明顯下降。3種稀釋比例下精液以NO-1稀釋液稀釋保存24 h，精子活率過低，不適于輸精；精液以NO-2稀釋液在1:1和2:1比例下稀釋保存16 h后不適于輸精，1:2比例下8 h不適用輸精；BJJX在16 h不適于受精；生理鹽水在1:1～1:2比例下保存16 h，在2:1比例保存8 h后不適用于輸精。

結(jié)果顯示，保存后期，實驗組精子活率高于生理鹽水組，精子受精能力的維持時間更長。

表2 稀釋液類型和稀釋比例對精子活率的影響

2.2 不同稀釋比例的稀釋液對精子質(zhì)膜完整率的影響經(jīng)測定，新鮮精液質(zhì)膜完整率0.92。由表3可見，在3個稀釋比例下，各組質(zhì)膜完整率都隨保存時間的延長而不斷下降。各組的精子質(zhì)膜完整率差異不顯著。

2.3 NO-1、NO-2和BJJX 3種稀釋液對受精率的影響由表4可見，與生理鹽水相比，3種稀釋液受精率均極顯著提高。NO-1稀釋液的受精率最高，極顯著高于NO-2稀釋液，同時NO-1和BJJX組種蛋合格率顯著高于生理鹽水對照組。

表4 稀釋液對受精率的影響 %

3 討論

3.1 稀釋比例對精子活率的影響 精子活率是評價精子授精潛力的重要指標。精液稀釋比例對保存期間的精子活率具有很大影響。精液稀釋可以大幅提高番鴨精液利用率，充分發(fā)揮公鴨的繁殖潛力，降低精漿中精子的粘滯性，防止精子的提前活化。本實驗中相比于1:1和1:2比例，稀釋比例為2:1時，保存后期精子活率更低。這主要是由于較低的稀釋比例往往造成精漿-稀釋液中精子密度過大，精子代謝產(chǎn)物積累過快[10]，同時會造成精漿-稀釋液中能源物質(zhì)如糖的快速消耗，造成精子保存時間短，不利于精子運動能力的長久保持。本實驗中，NO-2組精液隨稀釋比例的增大而表現(xiàn)出保存質(zhì)量的下降，隨精子稀釋比例的增大，精漿中糖類等營養(yǎng)物質(zhì)及緩沖物質(zhì)濃度會隨之下降[11-12]，對精子的保護緩沖作用降低。稀釋液添加會通過改變精子密度從而明顯影響精液保存質(zhì)量，包括精子活率和質(zhì)膜完整率[13-14]。因此，具體稀釋比例需要根據(jù)鮮精精子活率和精子密度而決定。

本實驗中，在各個稀釋比例下，NO-1與BJJX稀釋液的精子活率高于NO-2和生理鹽水，這與NO-1與BJJX中高含量的單糖有關(guān)，較高含量的糖保證保存期間精子的代謝消耗，延長精子保存時間。

3.2 稀釋液對精子活率和受精率的影響 稀釋液的稀釋效果與稀釋液組分密切相關(guān)[15]。合理的稀釋液配方對精漿-稀釋液中精子運動能力的維持、形態(tài)穩(wěn)定以及精子代謝的正常進行具有非常重要的作用[16-17]。本研究中，在相同稀釋比例下，NO-1稀釋液較其余3組精子活率更高，這與NO-1稀釋液組分有關(guān)。有研究表明，相同稀釋介質(zhì)下果糖的稀釋效果要優(yōu)于葡萄糖[18]；高含量的谷氨酸鈉則為精子膜的完整性提供保障，延緩精子膜的損傷性變化，降低精子畸形的發(fā)生[19]；同時Tris的添加有效緩沖了因精子代謝造成的精漿-稀釋液理化性的惡化（如pH下降）[20]，對精液保存起到有效的緩沖作用。NO-2稀釋液的精子活率低于BJJX稀釋液，可能是由于NO-2稀釋液組分中單糖含量過低，單糖作為能源物質(zhì)是稀釋液的重要組分，單糖含量太少，不足以支撐精子細胞長期代謝的能量消耗。

保證單位體積精漿-稀釋液中含有足夠的活性精子數(shù)可獲得更高的受精率，因此在相同比例下，更高精子活率、更長保存時間的NO-1稀釋液表現(xiàn)為更高的受精率。

3.3 稀釋液和稀釋比例對質(zhì)膜完整性的影響 精子質(zhì)膜作為精子細胞與外界環(huán)境的屏障，控制精子與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，也是保存期間精子細胞最容易遭受損傷的部位。因此，檢測評估保存期間的精子膜完整性具有非常重要的意義。本實驗中，各組精子質(zhì)膜完整率均隨保存時間的延長而降低。精液保存過程中，精漿中精子代謝產(chǎn)物不斷積累，使精子保存環(huán)境的理化性質(zhì)惡化，以及精漿中活性氧的積累均會對精子膜造成損傷，從而最終導(dǎo)致實驗組與對照組精子質(zhì)膜完整性的不斷下降。此外，糖尤其是果糖作為能量和必需氨基酸的重要來源，在精子細胞膜破裂損傷過程中起著重要的作用[21]。而隨著稀釋液中單糖不斷消耗，導(dǎo)致保存后期稀釋液的保護作用降低，精子膜損傷增加。各實驗組之間質(zhì)膜完整性差異不顯著，可能是由于實驗組和對照組滲透壓與精子細胞接近等滲。

4 結(jié)論

稀釋液的稀釋效果與稀釋比例以及稀釋液本身的組分有很大關(guān)系。番鴨精液在保存或授精前應(yīng)選用恰當配方的稀釋液適當稀釋，精液與稀釋比例適宜在1:1～1:2。本實驗中NO-1稀釋液是番鴨精液人工授精稀釋和在17℃下短期保存的最佳稀釋液，通過提供精子外源能量和保證精子能量代謝所必需的適宜環(huán)境，延長精子保存時間。