王文濤，李燕，黃婷，張亞莉

我國成年人患慢性腎臟?。–KD）的比例為10.8%，預(yù)計我國現(xiàn)有的成年人CKD患者達1.2億[1]。腎間質(zhì)纖維化（RIF）是CKD發(fā)展至終末期腎?。‥SRD）的主要病理基礎(chǔ)[1]，也是反映腎功能下降嚴重程度、判斷預(yù)后的重要指標之一[2]。而目前臨床缺乏診斷RIF簡單易行的可靠指標。本研究旨在探討Masson染色聯(lián)合圖像半定量分析對RIF的診斷價值，找到客觀易行的評價RIF的指標，以盡早進行預(yù)防和抑制這一變化過程，對延緩CKD病情進展具有十分重要的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年1—9月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科行腎活檢、排除繼發(fā)性腎臟疾病、診斷為慢性間質(zhì)性腎炎（CIN）及慢性腎小球疾?。–GD）患者149例作為RIF組，其可分為CIN亞組（包括病理診斷為小管間質(zhì)性炎，伴或不伴系膜增生性腎小球腎炎患者，n=26）、CGD亞組（n=123）。根據(jù)CGD常見類型，分為IgA腎?。↖gAN，包括伴有腎小球硬化的IgAN患者，n=79）、慢性腎小球腎炎（n=44）；根據(jù)LEE氏標準[3]將IgAN分為IgAN Ⅱ級（n=3）、IgAN Ⅲ級（n=35）、IgAN Ⅳ級（n=25）、IgAN Ⅴ級（n=16），根據(jù)慢性腎小球腎炎硬化程度分為局灶硬化性腎小球腎炎（FSGN，n=31）、增生硬化性腎小球腎炎（PSGN，n=10）、硬化性腎小球腎炎（SGN，n=3）。將同期于本院行腎臟穿刺活檢明確無RIF的Ⅰ～Ⅱ期膜性腎病患者27例作為對照組。

1.2 生化檢查 全自動生化檢測儀測定研究對象在入院期間的血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、胱抑素C。全自動流式血細胞計數(shù)儀測定研究對象在入院期間的血紅蛋白（Hb）。放射免疫法測定研究對象在入院期間的血及尿β2微球蛋白（β2-MG）。

1.3 圖像軟件處理 將西安交通大學第一附屬醫(yī)院病理科制好的Masson染色的腎臟病理切片，使用Nikon801 正置熒光顯微鏡 Plan Fulor 40X/0.75 物鏡、目鏡 10X/22（×400）采集圖像，輸入 Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀測量系統(tǒng)，選擇HSI模式（將吸管顏色設(shè)定為黃色），設(shè)置H、S、I參數(shù)，當H在“117～200”、S在“0～255”、I在“180～240”時基本可以選中圖片中所有的膠原纖維。測量陽性區(qū)域總積分光密度，每張病理切片取5個視野（上、下、左、右及中央）定量檢測Masson染色的腎臟病理切片的積分光密度，總積分光密度與測量區(qū)域總面積相除，計算出平均光密度（MOD）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以病理結(jié)果為金標準，構(gòu)建MOD診斷RIF的受試者工作特征曲線（ROC曲線），計算最佳截斷值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RIF組與對照組

2.1.1 基本資料 RIF組和對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.1.2 RIF組與對照組的臨床指標 RIF組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；RIF組和對照組Hb比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.173，見表2）。

本文創(chuàng)新點：

本研究通過測量腎間質(zhì)的平均光密度（MOD）來間接反映腎臟間質(zhì)纖維化程度，減少病理科醫(yī)師主觀影響，希望能為腎臟間質(zhì)纖維化患者的診斷提供新的依據(jù)。

本文不足：

（1）本課題僅檢測了Masson染色的病理組織切片中腎間質(zhì)的MOD，未對其他染色方法的MOD做相關(guān)研究；（2）本文病例數(shù)較少，如有條件，可通過大樣本量的病例研究以減小誤差影響；（3）如有條件，可通過動物實驗并同步進行與纖維化相關(guān)的因子檢測并進行比較，以助于進一步確定診斷界值。

表1 RIF組和對照組基本資料比較Table 1 General characteristics of RIF group and control group

表2 RIF組和對照組臨床指標比較Table 2 Clinic indicators of RIF group and control group

2.1.3 RIF組MOD與臨床指標的相關(guān)性 RIF組MOD為 0.017 9（0.015 2，0.023 3）。RIF 組的 MOD 與 Scr、血及尿β2-MG呈正相關(guān)，與Hb呈負相關(guān)（P＜0.05）；RIF組的MOD與BUN、胱抑素C無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見表3）。

表3 RIF組MOD與臨床指標相關(guān)性Table 3 Correlations of MOD and clinic indicators in RIF group

2.1.4 RIF組與對照組MOD比較 對照組MOD為0.005 6（0.004 1，0.007 3）。RIF組的MOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-7.954，P=0.001）。

2.1.5 MOD診斷RIF的價值 MOD診斷RIF的ROC曲線下面積為0.982〔95% CI（0.961，1.000）〕，最佳截斷值為0.012 3，靈敏度為0.886，特異度為0.963，見圖1。

圖1 MOD診斷RIF的ROC曲線Figure 1 The AUC of MOD in the diagnosis of RIF

2.2 CIN亞組、CGD亞組、對照組比較

2.2.1 基本資料 三組性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。三組年齡比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CIN亞組年齡高于CGD亞組、對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CGD亞組和對照組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表4）。

表4 CIN亞組、CGD亞組、對照組基本資料比較Table 4 General characteristics of CIN and CGD subgroups and control group

2.2.2 臨床指標 三組BUN、Scr、胱抑素C、Hb、血及尿β2-MG比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CIN亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CIN亞組Hb低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CGD亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。CIN亞組BUN、Scr、胱抑素C、血及尿β2-MG高于CGD亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CIN亞組Hb低于CGD亞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表5）。

2.2.3 MOD CIN 亞組 MOD 為 0.019 1（0.015 6，0.025 2），CGD 亞組 MOD 為 0.017 6（0.015 1，0.023 3）。三組的MOD比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=64.536，P＜0.05）。CIN亞組MOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-6.138，P＜0.05）。CGD亞組MOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-7.790，P＜0.05）。CIN亞組和CGD亞組MOD比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=-1.298，P＞0.05）。

表5 CIN組、CGD組、對照組臨床指標比較Table 5 Clinic indicators of CIN and CGD subgroups and control group

2.2.4 MOD診斷CIN亞組、CGD亞組RIF的價值 以病理結(jié)果為金標準，MOD診斷CIN亞組RIF的ROC曲線下面積為0.991〔95% CI（0.975，1.000）〕，最佳截斷值為0.011 8，靈敏度為1.000，特異度為0.926，見圖2。

MOD診斷CGD亞組RIF的ROC曲線下面積為0.980〔95% CI（0.958，1.000）〕，最佳截斷值為0.008 0，靈敏度為0.992，特異度為0.852，見圖2。

圖2 MOD診斷CIN亞組、CGD亞組RIF的ROC曲線Figure 2 The ROC curves of MOD in the diagnosis of RIF in CIN and CGD subgroups

2.2.5 三組MOD與臨床指標的相關(guān)性 CIN亞組和對照組的MOD與臨床指標無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。

CGD亞組MOD與胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相關(guān)，與Hb呈負相關(guān)（P＜0.05）；CGD亞組MOD與BUN、Scr無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05，見表6）。

2.3 對照組與不同IgAN分級患者MOD比較 IgAN患者 MOD 為 0.007 7～0.036 5，對照組 MOD 為 0.003 0～0.014 9。對照組、不同IgAN分級患者MOD比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IgAN Ⅱ、IgAN Ⅲ、IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ級患者MOD均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.800、-6.126、-5.925、-5.402，P值均＜0.001）；且IgAN Ⅳ、IgAN Ⅴ級患者MOD均高于IgAN Ⅲ級，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.122、-2.395，P=0.034、0.017，見表7）。

2.4 對照組與不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者MOD比較 慢性腎小球腎炎患者 MOD 為 0.009 1～0.035 8。對照組與不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者MOD比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中FSGN、PSGN、SGN患者的MOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-6.337、-4.617、-2.800，P值均＜0.001）；PSGN的MOD高于FSGN，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.398，P＜0.05，見表 8）。

表6 CIN亞組、CGD亞組、對照組的MOD與臨床指標的相關(guān)性Table 6 Correlations of MOD with clinic indicators in CIN and CGD subgroups and control group

表8 不同慢性腎小球腎炎硬化程度患者與對照組的MOD比較〔M（P25，P75）〕Table 8 Comparison of MOD between patients with different degree of chronic glomerulonephritis and control group

3 討論

3.1 RIF概述 RIF是腎臟疾病發(fā)展至ESRD的主要病理基礎(chǔ)，RIF程度越重，提示腎功能損害越嚴重，預(yù)后越差。近年來諸多研究表明，無論是原發(fā)性腎小球疾病還是繼發(fā)性腎小球疾病，小管間質(zhì)病變的嚴重性與腎小球病變的活動性、腎臟組織學活動指標、腎功能受損程度均呈正相關(guān)[4-6]。腎小管間質(zhì)內(nèi)單核細胞、巨噬細胞浸潤的程度與腎功能損傷程度密切相關(guān)，并且腎功能減退的程度與小管間質(zhì)纖維化有密切的關(guān)系。因此，早期診斷，盡早進行干預(yù)，對于改善CKD患者生活質(zhì)量意義重大。目前關(guān)于RIF評估的臨床指標有限，臨床常用的BUN、Scr等血清學指標可反映腎功能，而尿β2-MG主要反映近端腎小管重吸收功能，尿液濃縮-稀釋試驗主要反映遠端腎小管及集合管的功能，均無法反映RIF的程度。有報道超聲、核磁共振等[7-9]檢查可評價RIF，病理切片的積分光密度[10-13]間接反映RIF，且需要檢測各種因子的表達，目前公認腎臟中的結(jié)締組織生長因子、單核細胞趨化因子蛋白1及轉(zhuǎn)化生長因子β1[10]是RIF發(fā)生發(fā)展的重要細胞因子，其表達越高提示RIF的程度可能越高，但因檢測要求技術(shù)高，費用高昂，目前主要應(yīng)用于動物實驗中，也有報道可以通過檢測血或尿中的單核細胞趨化因子蛋白1、轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子表達來反映RIF程度[14-16]。目前病理檢查為診斷RIF的金標準，其中Masson對膠原纖維的特殊染色，依靠病理醫(yī)師在顯微鏡下觀察來評定RIF程度，受醫(yī)師水平的影響，存在著主觀性且無法量化的指標評價纖維化程度，目前的計算機輔助病理診斷在臨床診斷方面逐漸得到應(yīng)用，但其主要通過檢測免疫組化病理切片的陽性面積或積分光密度來間接反映RIF，需要進行特殊染色以檢測各種因子，臨床操作復(fù)雜，費用高。本研究通過Masson染色聯(lián)合圖像處理軟件，計算不同腎組織間質(zhì)的MOD，以量化指標對RIF進行評價。

3.2 MOD與RIF 本研究結(jié)果顯示，CIN亞組、CGD亞組的MOD均高于對照組，提示該方法可以反映腎臟的纖維化病變，原因可能為：在慢性腎小球腎炎的病理改變中，早期以腎小球病變?yōu)橹?，隨著疾病的進展，腎臟間質(zhì)及小管也會發(fā)生改變。而在CIN中，腎間質(zhì)及小管的損害也可以通過增加腎小球后的阻力、降低腎小球濾過率，繼而引起腎小球硬化。

本研究結(jié)果顯示，MOD預(yù)測RIF的最佳截斷值為0.012 3，靈敏度為88.6%，特異度為96.3%；CIN亞組及CGD亞組的最佳截斷值分別是0.011 8、0.008 0，靈敏度分別是100.0%、99.2%，特異度分別是92.6%、85.2%，提示MOD可以間接反映RIF程度，且均有較高的特異度及靈敏度。建議對CIN及CGD可以取不同的界值。

目前我國主要按照LEE氏標準對IgAN進行分級[3]：IgANⅠ級，在絕大多數(shù)是正常的腎小球中，偶爾可見輕度系膜增寬伴或不伴細胞增生，腎間質(zhì)及小管無病變。IgANⅡ級，腎小球局灶性系膜增生和硬化程度小于50%，小新月體罕見，腎間質(zhì)及小管無病變。IgAN Ⅲ級，系膜彌漫增生、增寬（偶爾為局灶節(jié)段），小新月體少見，可出現(xiàn)局灶間質(zhì)水腫，細胞浸潤少見，腎小管萎縮罕見。IgAN Ⅳ級，腎小球重度彌漫增生和硬化，腎小球可呈部分或全部硬化，新月體≤45%，腎小管萎縮，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，間質(zhì)泡沫細胞少見。IgAN Ⅴ級，病變比Ⅳ級更重，腎小球新月體＞45%，腎小管和間質(zhì)病變比Ⅳ級重，原因可能為IgAN硬化程度越重，RIF程度越重有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，慢性腎小球腎炎不同硬化程度患者的MOD不同。FSGN的腎小球呈局灶節(jié)段性分布，病變腎小球系膜基質(zhì)增多，呈無細胞性硬化，腎間質(zhì)及小管病變常伴發(fā)；PSGN的腎小球硬化程度在50%左右，伴有其他腎小球的增生性病變及腎間質(zhì)和小管的嚴重病變；SGN的腎小球硬化超過75%以上，伴有腎間質(zhì)和小管的嚴重病變[17]，原因可能為硬化程度越重，RIF程度越重。

3.3 RIF與臨床指標的關(guān)系 本研究結(jié)果顯示，RIF組的MOD水平與Scr、血及尿β2-MG呈正相關(guān)，與Hb呈負相關(guān)，提示有RIF的患者，其RIF程度越重腎功能損害也越重，原因可能為CIN隨病變進展也會累及腎小球。本研究結(jié)果顯示，CGD亞組的MOD與Hb呈負相關(guān)，與胱抑素 C、血及尿β2-MG呈正相關(guān)，提示慢性腎小球腎炎組的RIF程度越重，腎功能損害也越重，原因可能為臨床上CGD早期是以腎小球病變?yōu)橹?，但隨著病變進展會合并間質(zhì)及小管病變。

綜上，通過Image-Pro Plus 6.0軟件采集腎臟病理間質(zhì)圖像，計算出MOD是一種簡單、易操作，可重復(fù)性的檢測方法，并可以以量化的指標反映RIF程度，為臨床治療提供依據(jù)及幫助，以改善患者生活質(zhì)量，延長生命。但因為本研究為回顧性研究，且關(guān)于界值、靈敏度及特異度也沒有參考，臨床診斷與病理類型對RIF的關(guān)系也未進行相關(guān)研究，因此還需大量的基礎(chǔ)研究及臨床研究來進一步探索。

本文無利益沖突。