陳思 邢曉靜

摘要：目的 觀察山慈菇含藥血清對(duì)人乳腺SK-BR-3細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移能力的影響。方法 選用20只SD雌性大鼠，2月齡，體重（200±20）g，使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組大鼠按0.01 mL/g灌胃山慈菇濃煎劑，對(duì)照組大鼠給予等體積的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)6d，末次灌胃后，腹主動(dòng)脈取血，制作含藥血清;同時(shí)培育人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞。使用MTT法檢測(cè)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖情況、熒光顯微鏡觀察SK-BR-3凋亡情況以及劃痕試驗(yàn)檢測(cè)SK-BR-3細(xì)胞遷移情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組能夠明顯抑制人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及延緩人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞向劃痕中央聚集。結(jié)論 山慈菇含藥血清能夠有效抑制人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞活性，并加速細(xì)胞凋亡以及延緩細(xì)胞的遷移能力。

關(guān)鍵詞：山慈菇含藥血清;人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞遷移

【Abstract】Objective：To observe the effects of Iphigenia indica Kunth drug serum on the proliferation，apoptosis and migration ability of human breast SK-BR-3 cells. Methods：20 SD female rats of 2 months old and weighing （200 ± 20）g were randomly divided into an experimental group and a blank control group by using a random number table method，10 rats per group. The rats in the experimental group were administered with Iphigenia indica Kunth decoction and the rats in the control group were given the same volume of physiological saline once a day for 6 days. In the last time，the abdominal aorta was taken for blood to make drug serum. At the same time human breast cancer SK-BR-3 cells were bred. MTT method was used to detect the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells. SK-BR-3 apoptosis was observed by using a fluorescence microscope，and SK-BR-3 cell migration was detected by a scratch test. Results：Compared with the control group，the experimental group can significantly inhibit the proliferation of the human breast cancer SK-BR-3 cells，induce cell apoptosis and delay the accumulation of the human breast cancer SK-BR-3 cells toward the center of the scratch. Conclusion：Iphigenia indica Kunth drug serum can effectively inhibit human breast cancer SK-BR-3 cell activity，accelerate cell apoptosis and delay cell migration.

【Key words】Iphigenia indica Kunth drug serum，human breast cancer SK-BR-3 cells，cell apoptosis，cell migration

乳腺癌是常見的女性疾病之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)、化療及放療等治療手段不斷提高，雖然總體5年內(nèi)的生存率得到明顯提升，但是死亡人數(shù)依然居高不下，嚴(yán)重威脅著女性的健康安全[1]。同時(shí)靶向藥物雖然能夠延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但是整體治療效果不能夠達(dá)到預(yù)期，并且其毒副作用往往降低患者的生存質(zhì)量[2]。現(xiàn)代中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)山慈菇中藥能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂，降低腫瘤的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移，并且毒副作用小，能夠更好的改善患者的生存質(zhì)量[3]。

山慈菇始載于《本草拾遺》，性甘、涼、微辛，具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功，在腫瘤的治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能夠通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂、遷徙以及心血管的生成，從而達(dá)到治療腫瘤的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察山慈菇含藥血清對(duì)乳腺癌SK-BR-3腫瘤細(xì)胞的影響作用，探討其干預(yù)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移能力的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及動(dòng)物的制備 選用20只SD雌性大鼠，2月齡，體重（200±20）g，使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組10只。

細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，將細(xì)胞放置于含有10%特級(jí)牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，SK-BR-3細(xì)胞繁殖到80%融合時(shí)，使用消化液將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代。隨機(jī)選擇對(duì)數(shù)期的SK-BR-3細(xì)胞放在CO2培育箱中，每隔24h進(jìn)行換液傳代[5]。

藥物制備：100 g山慈菇第1次加入8倍量的水煎煮30 min，第2次加入4倍量的水煎煮20 min，合并濾液，進(jìn)行過濾，然后將濾液濃縮至1.21 g生藥/mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥 根據(jù)成人每日臨床劑量30 g，按大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍計(jì)算，且大鼠胃容量為0.875mL/100 g[6]。山慈菇組大鼠給藥劑量為：山慈菇濃煎劑0.01 mL·（g·d）;對(duì)照組大鼠給予等體積的生理鹽水，每日灌胃1次，連續(xù)6d。

2.2 實(shí)驗(yàn)取材 取材當(dāng)天，禁食水，在大鼠末次給藥2h后，以0.015mL/g劑量的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射，麻醉大鼠，用無抗凝劑的真空采血管從大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，3000 r/min 離心10 min，取上層血清，置于56℃水浴中滅活30 min，最后，使用過濾器濾過血清進(jìn)行除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

2.3.1 MTT法檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況 將人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞以1乘10*5/mL接種于96孔板上，每孔100 uL置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組予以藥物干預(yù)，全部置于培養(yǎng)箱中48 h，用4℃生理鹽水洗2次，加0.5 mg /mL MTT溶液100 μL，避光，孵育4 h，加入150 μL DMSO，繼續(xù)避光，并搖床搖勻15 min后上機(jī)檢測(cè)，分析乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞抑制率[7]。

2.3.2 熒光顯微鏡觀察山慈菇含藥血清作用前后對(duì)SK-BR-3凋亡情況的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，以1乘10*5/mL密度接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞貼壁24 h后吸出原培養(yǎng)液，每孔加入2 mL質(zhì)量濃度不同的含藥血清作為實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)立兩個(gè)復(fù)孔;同時(shí)以加入等量培養(yǎng)基的乳腺癌 SK-BR-3細(xì)胞作為對(duì)照組。放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，吸除原培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗2遍，再加入4%甲醛固定20 min，繼續(xù)以PBS洗滌2 min，待其晾干，加入0.1%TritonX-100處理3次（每次10 min），間隔PBS洗滌10 min，再將生理鹽水配成的0.05 mg /mLDAPI染液進(jìn)行染色，常溫下避光20 min，吸出染料后PBS洗滌2次。最后，在熒光顯微鏡下觀察SK-BR-3細(xì)胞的細(xì)胞核的形態(tài)[8]。

2.3.3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞遷移情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞接種于每孔2 mL的6孔板中，細(xì)胞密度為5×10*4/mL，培養(yǎng)24h，用200 μL無菌槍頭依次在每個(gè)孔底劃“十”字劃痕，生理鹽水洗2遍，拍照記錄后分別加入含藥血清作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)立對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后，于顯微鏡下觀察劃痕愈合度，拍照記錄分析細(xì)胞的遷移情況[9]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 MTT法檢測(cè)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況結(jié)果 不同濃度的山慈菇含藥血清（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）處理人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞48h，SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況分別為（0.860±0.063）%、（0.747±0.064）%、（0.484±0.039）%、（0.149±0.055）%、（0.128±0.029）%、（0.111±0.008）%、（0.104±0.019）%、（0.101±0.023）%、（0.100±0.019）%（見圖1）。與對(duì)照組比較，山慈菇含藥血清濃度在10%時(shí)，對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖無明顯的抑制作用（P>0.05），當(dāng)濃度達(dá)到20%時(shí)，能夠明顯的抑制對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的增殖（P<0.05），隨著濃度的增加，對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的增殖作用約強(qiáng)。

3.2 熒光顯微鏡觀察山慈菇含藥血清作用前后SK-BR-3凋亡情況結(jié)果 由熒光結(jié)果可知（圖2），對(duì)照組圖片表現(xiàn)為均勻的淡藍(lán)色熒光反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組熒光圖片為山慈菇含藥血清誘導(dǎo)后的SK-BR-3細(xì)胞，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特征，如核碎裂、核染色質(zhì)濃縮聚集以及藍(lán)白色熒光等。因此實(shí)驗(yàn)組SK-BR-3凋亡情況較對(duì)照組明顯，所以山慈菇含藥血清能夠明顯誘導(dǎo)SK-BR-3細(xì)胞凋亡。

3.3 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞遷移情況結(jié)果 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞遷移情況結(jié)果顯示：對(duì)照組SK-BR-3細(xì)胞24h后向劃痕中間聚集，而山慈菇含藥血清圖片中有明顯更少的SK-BR-3細(xì)胞向中央聚集。由此可知，山慈菇含藥血清能夠明顯的抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的遷徙能力。

4 討論

乳腺癌是一種風(fēng)險(xiǎn)極高的癌癥，可能通過轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)危及患者的生命安全，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，所以乳腺癌的發(fā)病機(jī)制越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。

乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)中“乳巖”范疇，多為本虛標(biāo)實(shí)之證，陽氣不足，沖任失調(diào)，抑制痰飲、瘀血等實(shí)邪，互結(jié)于乳絡(luò)，治當(dāng)以活血化痰散結(jié)之法[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺細(xì)胞的異常增殖和凋亡可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病的重要機(jī)制之一，如何調(diào)控乳腺細(xì)胞的異常增殖和凋亡是解決乳腺癌的關(guān)鍵。細(xì)胞凋亡是在細(xì)胞基因的調(diào)控下，引起細(xì)胞自主凋亡的過程[10]。

目前的治療手段依舊以手術(shù)和放療、化療為主，其創(chuàng)傷性和化療藥物帶來的副作用巨大。由于患者對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)不足，當(dāng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌時(shí)，往往為疾病的晚期，通常會(huì)錯(cuò)過本病的最佳治療時(shí)間，在臨床治療中常加大化療藥物的劑量，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的，但由于藥物劑量的增大，毒副作用亦明顯，而且長(zhǎng)期使用使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，后期治療效果不佳。因此患者希望尋求一種溫和的治療方式，提高生命質(zhì)量，探索新的治療藥物也能成為醫(yī)學(xué)界的最關(guān)注的熱點(diǎn)。山慈菇化痰散結(jié)，常用于乳巖的治療，而現(xiàn)代藥理亦表明山慈菇具有抗腫瘤、抗血管活性等作用，特別是在抗腫瘤中的作用受到重視，認(rèn)為山慈菇能夠通過抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡、延緩其遷移能力，從而達(dá)到治療乳腺癌的作用[11]。

相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，藥物抗腫瘤的作用機(jī)制主要為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞行為等方面[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山慈菇含藥血清干預(yù)乳腺癌細(xì)胞后，能夠明顯抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的活性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且在藥物濃度為20%時(shí)作用顯著，隨著濃度的增加，其抑制作用越強(qiáng)，表現(xiàn)為濃度依賴性。在熒光實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組中SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)山慈菇含藥血清誘導(dǎo)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡;在劃痕實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞和對(duì)照組比較，向中央遷移明顯較少，表明山慈菇含藥血清能夠明顯延緩腫瘤細(xì)胞的遷徙，從而逆轉(zhuǎn)其行為。綜上所述，山慈菇含藥血清可能通過抑制腫瘤SK-BR-3細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)SK-BR-3細(xì)胞的凋亡以及延緩SK-BR-3的遷移，從而達(dá)到治療乳腺癌的目的，但是其具體的分子機(jī)制仍未明確，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

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