孟藝宏 徐剛標(biāo) 盧孟柱,2 姜小龍,3 郭飛龍

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410004； 2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州311300； 3. 中國(guó)科學(xué)院上海辰山植物園 上海 201602)

遺傳多樣性是生物長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物。探討生物種群進(jìn)化歷史，是理解歷史環(huán)境因子和人為因素對(duì)現(xiàn)實(shí)種群地理分布格局、豐富度及進(jìn)化潛力影響的理論基礎(chǔ)(Cabreraetal., 2017)。我國(guó)亞熱帶山區(qū)多數(shù)原始森林植被是由暖溫帶落葉闊葉林和常綠闊葉林組成，是北半球溫帶植物區(qū)系中物種多樣性和特有性程度最高的地區(qū)，分布18 000余種種子植物，其中50%～60%為特有種(Wangetal., 2015)，為中國(guó)-日本植物區(qū)系的核心部分，被認(rèn)為是古老的植物演化譜系在第四紀(jì)冰期的重要避難所，成為全球生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一(葉俊偉等， 2017)。基于化石孢粉數(shù)據(jù)重建的植被分布模式(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)表明，我國(guó)亞熱帶植物在末次冰盛期明顯向南退縮，冰期后從避難所內(nèi)原地(insitu)周邊經(jīng)歷局部擴(kuò)張，在冰期/間冰期的氣候波動(dòng)過程中，大多數(shù)植物可能選擇在多地避難所幸存下來。隨著分子種群遺傳學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，利用現(xiàn)實(shí)種群的遺傳信息推測(cè)種群進(jìn)化歷史、多樣性起源、分布和維持的潛在機(jī)制成為可能(Beaumontetal., 2004)。

長(zhǎng)柄雙花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)(2n=16) 系金縷梅科(Hamamelidaceae)雙花木屬(Disanthus)植物(潘開玉等，1994)，為我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺植物，殘存于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈海拔1 300 m以下的常綠闊葉林和針闊葉混交林或矮林中。該物種對(duì)生境條件要求苛刻，適宜在溫暖濕潤(rùn)氣候和酸性土壤上生長(zhǎng)，分布區(qū)狹窄，種群數(shù)量少，已被列為我國(guó)Ⅱ級(jí)保護(hù)植物和珍稀瀕危植物(高浦新等， 2013； 孟藝宏等， 2019)。長(zhǎng)柄雙花木為多年生的落葉灌木或小喬木，樹高2～3 m(溪谷兩側(cè)的植株可達(dá)7 m)，叢生。頭狀花序上對(duì)生2朵無梗的兩性花，花序柄細(xì)長(zhǎng)。自交親和，以昆蟲和風(fēng)傳播花粉，“花多果少”，種子主要依靠風(fēng)力傳播(肖宜安等， 2004)。心型葉，互生，葉色由初春綠色變?yōu)樯钋镒霞t色，花、果紅色，觀賞價(jià)值高，極具有園林綠化市場(chǎng)的開發(fā)利用潛力(廖飛勇， 2010)。作為雙花木屬中國(guó)-日本植物區(qū)系的替代種，該物種在研究金縷梅科系統(tǒng)發(fā)育和東亞植物區(qū)系地理演化等方面具有重要的科學(xué)價(jià)值(高浦新等， 2013)，是探討第四紀(jì)冰期以來我國(guó)亞熱帶地區(qū)植物分布格局及種群遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)空變化機(jī)制的模式植物之一。

有關(guān)長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳學(xué)研究較少?，F(xiàn)有的研究報(bào)道，由于樣本采集于不同的局部區(qū)域以及采用不同的標(biāo)記系統(tǒng)，存在著差異性結(jié)論。肖宜安等(2003)基于同工酶標(biāo)記開展羅霄山脈井岡山地區(qū)5個(gè)種群遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)種群遺傳多樣性較高，種群遺傳分化較?。?謝國(guó)文等(2014)采用ISSR標(biāo)記分析南嶺山脈5個(gè)種群遺傳多樣性的結(jié)果顯示，種群遺傳多樣性偏低，種群間遺傳差異不大； Yu等(2014)采用AFLP標(biāo)記分析8個(gè)種群遺傳多樣性的結(jié)果表明，種群維持較豐富的遺傳多樣性，種群遺傳分化明顯。鑒于此，本研究基于熒光SSR標(biāo)記技術(shù)，采集長(zhǎng)柄雙花木全分布區(qū)12個(gè)代表性自然種群，分析其種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，探討現(xiàn)實(shí)種群遺傳結(jié)構(gòu)的歷史成因，旨在為該物種遺傳資源保護(hù)與開發(fā)利用策略的制定提供理論基礎(chǔ)，也為理解我國(guó)亞熱帶地區(qū)植物多樣性的起源和維持機(jī)制提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017—2018年，參考文獻(xiàn)(高浦新等， 2013)和各地植被本底調(diào)查資料，選擇12個(gè)長(zhǎng)柄雙花木自然種群(表1)，采集嫩葉開展遺傳多樣性研究。為避免采樣個(gè)體親緣關(guān)系近，盡可能選取同齡級(jí)植株(株高3 m左右)，樣株間距20 m以上(徐剛標(biāo)， 2016)，共采集261個(gè)植株的葉片樣本。采集的嫩葉立即放入裝有硅膠的自封袋中，GPS定位采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度和海拔，記錄種群大小及采集的樣本數(shù)。葉片樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，倒出硅膠后密封，放入-4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 長(zhǎng)柄雙花木采樣信息、樣本量及種群遺傳多樣性參數(shù)①Tab.1 Sampling information, sample size and population genetic diversity of D. cercidifolius var. longipes

根據(jù)Gao等(2009)和孟藝宏等(2018)開發(fā)的長(zhǎng)柄雙花木特異SSR引物序列信息，篩選出15對(duì)能獲得多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR 引物(表2)。引物由上海Sangon公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取、TP-M13-SSR擴(kuò)增及基因分型 采用孟藝宏等(2018)改良的CTAB法提取葉片DNA，TP-M13-SSR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管自動(dòng)熒光電泳系統(tǒng)ABI 3730XL對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。TP-M13-SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序，同孟藝宏等(2018)。

采用Gene Marker V4.0(http:∥www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/software-down loads.html)，判讀PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度大小。1個(gè)峰，視為純合子； 2個(gè)峰，視為雜合子。

1.2.2 遺傳參數(shù)估算 采用FSTAT2.9.3(http:∥www.bio-soft.net/tree/FSTAT.html)，統(tǒng)計(jì)估算種群及位點(diǎn)上的等位基因數(shù)(NA)、有效等位基因數(shù)(NE)、觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE)，以及種群私有等位基因豐富度(pAR)和種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)(Weiretal., 1984)，并對(duì)各位點(diǎn)和種群進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)。

1.2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析 采用FSTAT2.9.3，估算成對(duì)種群間遺傳分化系數(shù)(FST)(Weiretal., 1984)。

采用STRUCTURE 2.3(http:∥pritch.bsd. ushicago.edu/structure.html)，對(duì)所有參試個(gè)體進(jìn)行Bayesian聚類分析?；诜N群間等位基因頻率相互獨(dú)立(independent allele frequencies)的假設(shè)，采用獨(dú)立等位基因頻率混合模型(admixture model)，設(shè)定類群數(shù)(K)為1～12(參試種群數(shù))，Length of Burn-in Period和MCMC均為10 000，每個(gè)K值運(yùn)行12次。根據(jù)獨(dú)立運(yùn)行每個(gè)K值所獲得的后驗(yàn)概率lnP(D)，計(jì)算ΔK值。ΔK最大值對(duì)應(yīng)的K值視為最合理的類群數(shù)(Evannoetal., 2005)。用STRUCTURE 2.3分析參試個(gè)體歸屬各類群的比率(Q>0.6)，確定個(gè)體歸屬的類群。

采用ARLEQUIN 3.2(https:∥www.softpedia.com/get/Science-CAD/Arlequin.shtml) 中分子方差分析(AMOVA) 選項(xiàng)，估算種群間、種群內(nèi)遺傳方差分量，10 000次置換，評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)顯著性。

1.2.4 種群歷史事件推測(cè) 采用Bottleneck1.2.02(http:∥www.montpellier.inra.fr/URLB/bottleneck/bottleneck. html)軟件中Wilcoxon單側(cè)檢驗(yàn)法選項(xiàng)，選擇雙相突變模型(two-phased mutation model, TPM)，基于種群雜合度過剩概率，檢測(cè)每個(gè)種群是否經(jīng)歷遺傳瓶頸事件。10 000次置換，評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳多樣性

15對(duì)SSR引物對(duì)12個(gè)種群261株個(gè)體進(jìn)行TP-M13-SSR擴(kuò)增，共檢測(cè)到129個(gè)等位基因。各位點(diǎn)上的等位基因數(shù)(NA)為4(DC111)～15(DC115)，平均值為8.6； 有效等位基因數(shù)(NE)介于2.00～6.79之間，平均值為3.5。各位點(diǎn)觀測(cè)雜合度(HO)和期望雜合度(HE)變動(dòng)幅度分別為0.11～0.63和0.50～0.85，平均值分別為0.37和0.67(表2)。這表明，各SSR引物檢測(cè)出的位點(diǎn)多態(tài)性較高，長(zhǎng)柄雙花木種內(nèi)遺傳變異較豐富。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，所有位點(diǎn)都極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.001)。

種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表1)表明，種群中的等位基因數(shù)(NA)變異幅度為2.7～4.1，平均值為3.4； 有效等位基因數(shù)(NE)為1.74～2.50，平均值為2.1。種群觀測(cè)雜合度(HO)均小于期望雜合度(HE)，平均值分別為0.35和0.43。各種群中均有私有等位基因，平均值為0.15，但私有等位基因豐富度(pAR)差異較大(0.06～0.25)。這表明種群遺傳多樣性較豐富。所有參試種群中，井岡山種群(JGS)的各項(xiàng)遺傳參數(shù)最大，遺傳多樣性最高，其次為玉山種群(YS)； 湖南莽山種群(MS)除觀察雜合度(HO)外，其他各項(xiàng)遺傳參數(shù)最小，遺傳多樣性最低。平均種群內(nèi)近交系數(shù)(FIS)為0.19，除湖南道縣種群(DX)內(nèi)近交系數(shù)為負(fù)值(-0.02)，并未顯著偏離Hardy-Weinberg平衡以外，其他種群內(nèi)近交系數(shù)均為正值(0.10～0.40)，呈現(xiàn)出極顯著的不平衡狀況(P<0.001)。

2.2 長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳結(jié)構(gòu)

FSTAT2.9.3估算的成對(duì)種群間遺傳分化系數(shù)(FST)見表3。FST為0.169(YS與KH)～0.514(LQ與MS)，平均值為0.354。這表明，在整體上，種群間遺傳分化程度較高。

表3 長(zhǎng)柄雙花木成對(duì)種群FST的估算值Tab.3 The estimates of pairwise FST for D. cercidifolius var. longipes

基于Bayesian聚類的STRUCTURE 2.2軟件分析的結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，對(duì)應(yīng)的△K值最大，表明長(zhǎng)柄雙花木12個(gè)種群261株個(gè)體的最合理聚類組數(shù)為2。K=2情況下，根據(jù)每株個(gè)體歸屬于各類群的比值(Q)，繪制參試的植株個(gè)體歸屬2個(gè)類群的比例圖(圖1)。由圖1可知，龍泉(LQ)、開化(KH)、玉山(YS)和井岡山(JGS)種群聚為類群Ⅰ(紅色)，道縣(DX)、莽山(MS)、宜章(YZ)、連州(LZ)、邵陽(SY)、新寧(XN)、宜黃(YH) 和宜豐(YF)種群聚為類群II(綠色)。除宜章(YZ)(4株)、井岡山(JGS)(2株)、邵陽(SY)(2株)、宜黃(YH)(1株)種群中的少數(shù)個(gè)體(占比3.4%)歸屬于不同類群的Q值小于0.6外，大多數(shù)(96.6%)植株個(gè)體的譜系清晰。

AMOVA分析結(jié)果(表4)表明，長(zhǎng)柄雙花木種群內(nèi)變異分量占總變異的59.67%，種群間遺傳變異占總變異的40.33%，種群間遺傳差異極顯著(P<0.001)。

圖1 STURCTURE分析結(jié)果的直方圖(K=2)Fig.1 Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2

表4 長(zhǎng)柄雙花木種群分子方差分析Tab.4 The molecular variance analysis of populations of D. cercidifolius var. longipes

2.3 長(zhǎng)柄雙花木種群歷史

基于雙相突變模型檢測(cè)長(zhǎng)柄雙花木參試種群近期進(jìn)化歷史上是否經(jīng)歷遺傳瓶頸效應(yīng)的結(jié)果(表5)顯示，12個(gè)種群均未出現(xiàn)雜合子過?，F(xiàn)象(P>0.05)，所有種群中的等位基因分布模式為正常L型分布(normal L-shaped distribution)，不符合漂移模型(shifted mode)，表明長(zhǎng)柄雙花木種群未經(jīng)歷遺傳瓶頸事件。

表5 長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳瓶頸效應(yīng)檢測(cè)①Tab.5 Bottleneck detection for D. cercidifolius var. longipes

3 討論

3.1 長(zhǎng)柄雙花木自然種群的遺傳多樣性

我國(guó)南方地區(qū)山脈走向多變，地形復(fù)雜，物種多樣性和特有性程度高，是人類活動(dòng)較頻繁的經(jīng)濟(jì)地理區(qū)域，自然生境碎片化較為嚴(yán)重(Zhaoetal., 2012)。本研究表明，該區(qū)域特有物種長(zhǎng)柄雙花木維持較高水平的遺傳變異(表1、表2)，與前人的研究結(jié)論(肖宜安等， 2003； Yuetal., 2014)一致，也與基于SSR標(biāo)記分析我國(guó)南方同科植物檵木(Loropetalumchinense)(Yuanetal., 2015)的結(jié)果相類似。這表明，近期生境碎片化和遺傳漂變并未對(duì)其種群遺傳多樣性產(chǎn)生嚴(yán)重影響(Zhaoetal., 2012; Yuanetal., 2015)。

大量研究表明，一些珍稀、特有物種維持較高遺傳多樣性(Geetal., 2003; Zhaoetal., 2012； Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。遺傳多樣性高低與物種的演化歷史、冰期避難所種群的遺傳多樣性維持、分布區(qū)的地域特征、物種的生態(tài)習(xí)性及交配系統(tǒng)等諸多因素有關(guān)(Xiaoetal., 2015; Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。長(zhǎng)柄雙花木維持較高遺傳多樣性，可能與該物種起源古老、第四紀(jì)冰期種群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、現(xiàn)實(shí)種群為其避難所殘跡有關(guān)(Geetal., 2003; Behlingetal., 2007; Yuetal., 2014)。

本研究中，所有位點(diǎn)都偏離Hardy-Weinberg平衡(表2)。絕大多數(shù)(91.7%)種群內(nèi)近交系數(shù)為正值，呈現(xiàn)出極顯著的不平衡狀況，表現(xiàn)為雜合子缺失(表1)，揭示出種群內(nèi)普遍存在自交或近交(王雁紅等， 2015； Turchettoetal., 2016)，這符合長(zhǎng)柄雙花木植株叢生、自交親和的生物學(xué)特性。

3.2 長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

長(zhǎng)柄雙花木遺傳變異主要存在于種群內(nèi)(59.67%，表4)，與Yu等(2014)的研究結(jié)論基本一致。分子方差分析結(jié)果中的種群間變異組分(40.33%)與估算的成對(duì)種群遺傳分化系數(shù)平均值(0.354)相差不大，種群間遺傳分化程度較高。但是，與肖宜安等(2003)和謝國(guó)文等(2014)研究得出的種群間遺傳差異較小的結(jié)論相反。這可能與前人采集的樣本材料來源于局部區(qū)域有關(guān)。

植物種群遺傳分化程度受其交配系統(tǒng)、生活史、分布類型、花粉/種子傳播方式及分布范圍、隔離程度及進(jìn)化歷史等諸多因素影響。長(zhǎng)柄雙花木的繁育系統(tǒng)為混合交配系統(tǒng)，小粒種子依靠風(fēng)力傳播(肖宜安等， 2003)，但種群遺傳分化系數(shù)高于基于SSR標(biāo)記揭示的混合交配系統(tǒng)(0.26)、種子依靠風(fēng)力傳播(0.13)、特有(0.26)、窄域分布(0.23)的植物種群遺傳分化系數(shù)的統(tǒng)計(jì)平均值(Nybom， 2004)。這可能與該物種對(duì)生境要求特殊以及分布區(qū)的地形地貌特征有關(guān)。長(zhǎng)柄雙花木間斷分布于南嶺山脈、羅霄山脈及武夷山脈，多在空氣濕度大的溝谷、溪流兩旁生長(zhǎng)，種群間被走向多樣的高山阻隔。

STRUCTURE分析結(jié)果(圖1)表明，長(zhǎng)柄雙花木自然種群被聚為2個(gè)不同類群，個(gè)體譜系清晰，與Yu等(2014) 基于AFLP標(biāo)記技術(shù)的研究結(jié)果(南嶺類群和華東類群)基本吻合。

3.3 長(zhǎng)柄雙花木種群的歷史事件

更新世期間，我國(guó)亞熱帶地區(qū)的氣候溫和(Juetal., 2007)，長(zhǎng)柄雙花木可能廣泛分布于該地理區(qū)域。末次盛冰期(約2.2萬年前)，該地區(qū)氣溫比當(dāng)前低 4～6 ℃，明顯變干(Qiuetal., 2011)，但南嶺山脈、武夷山脈的氣候波動(dòng)較小(Fengetal., 2016)，可能為該物種生存提供了較適宜的生境條件，成為其避難所。

末次盛冰期以來，長(zhǎng)柄雙花木的潛在分布區(qū)收縮(孟藝宏等， 2019)，歷史種群中的等位基因分布模型為正常L型分布，沒有經(jīng)歷遺傳瓶頸事件(表5)，這表明該物種可能遭受末次盛冰期的氣候影響較小。長(zhǎng)柄雙花木種群進(jìn)化歷史過程不符合基于化石孢粉證據(jù)揭示的第四紀(jì)冰期亞熱帶植物“收縮-擴(kuò)張”模型(即冰期向低緯度遷移至避難所，間冰期及冰期后向高緯度擴(kuò)張)(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)。這與分布于我國(guó)南方的白菊木(Leucomerisdecora) (Zhaoetal., 2012)、甜櫧(Castanopsiseyrei)(Shietal., 2014)、三葉崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)(Wangetal., 2015)、檵木(Gongetal., 2016)的種群歷史過程相類似。Zhao等(2012)認(rèn)為，復(fù)雜的地形特點(diǎn)，可能會(huì)引起植物種群間諸多的地理隔離因素產(chǎn)生，在間冰期種群間仍然保持隔離。自然地理屏障隔離，以及氣候變遷和人類經(jīng)濟(jì)活動(dòng)造成的生境碎片化，導(dǎo)致種群間遺傳分化加劇，種群規(guī)模縮小甚至部分種群趨向滅絕，是長(zhǎng)柄雙花木現(xiàn)代地理分布格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要成因。

3.4 長(zhǎng)柄雙花木遺傳資源保護(hù)

長(zhǎng)柄雙花木種群間遺傳分化較大(表3、表4)，種群中私有基因較豐富(表1)。因此，保護(hù)種群遺傳多樣性，是防止該物種特異種質(zhì)流失的關(guān)鍵，也對(duì)維持種群遺傳結(jié)構(gòu)十分重要。目前，該物種的大多數(shù)種群分布于自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，自然生境得到了有效保護(hù)，但種群中的幼苗過少，為負(fù)增長(zhǎng)型結(jié)構(gòu)(繆紳裕等， 2014)。如何采取有效的營(yíng)林措施促進(jìn)其種群的自然更新能力，將是今后研究的重點(diǎn)。前期采樣發(fā)現(xiàn)，邵陽種群(SY)分布地已被當(dāng)?shù)卣?guī)劃為旅游區(qū)，而新寧種群(XN)的周邊為農(nóng)田，人為干擾破壞極為嚴(yán)重。因此，分布于自然保護(hù)區(qū)外的種群，建立自然保護(hù)小區(qū)的工作已顯得迫在眉睫。相對(duì)于其他種群，井岡山種群(JGS)和宜豐種群(YF)的遺傳多樣性最為豐富(表1)，應(yīng)重點(diǎn)開展這2個(gè)種群的生境監(jiān)測(cè)和種群生殖生物學(xué)特性研究，評(píng)估生境碎片化對(duì)小尺度種群空間遺傳結(jié)構(gòu)、交配系統(tǒng)的影響。加強(qiáng)長(zhǎng)柄雙花木的繁殖生物學(xué)特性和人工輔助授粉技術(shù)研究，突破其“花多果少”的繁殖瓶頸，對(duì)該物種自然種群恢復(fù)與重建、人工遷地保育和資源開發(fā)利用都尤為重要。

4 結(jié)論

近期生境碎片化和遺傳漂移對(duì)長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳多樣性影響較小。長(zhǎng)柄雙花木在物種和種群水平上，維持較豐富的遺傳變異，具有較高的進(jìn)化潛力。種群間的自然屏障，以及氣候變遷和人類干擾導(dǎo)致的種群生境碎片化，是其現(xiàn)代地理分布格局和種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要成因。本研究從物種水平上較全面地揭示了長(zhǎng)柄雙花木種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)特征，可為該物種遺傳資源保護(hù)策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。