朱成磊 李彩麗 李曉佩 史晶晶 高志民

(1. 國(guó)際竹藤中心 國(guó)家林業(yè)和草原局/北京竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 北京 100102； 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193)

微管、微絲和中間纖維組成細(xì)胞骨架，其中微管的基本組成單位是微管二聚體，主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白通過(guò)共價(jià)鍵作用形成的中空管狀結(jié)構(gòu)(Downingetal., 1998)。微管在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，不僅參與細(xì)胞分裂(Rasmussenetal., 2013)、細(xì)胞形態(tài)建成及維持(Burketal., 2002; Krtkováetal., 2016)，還參與指導(dǎo)細(xì)胞壁物質(zhì)的合成(Catteronetal., 2001)，通過(guò)影響細(xì)胞壁的組分和結(jié)構(gòu)調(diào)控細(xì)胞的伸長(zhǎng)(Paredezetal., 2006; Gutierrezetal., 2009)，而且在植物生物和非生物脅迫下，微管同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用(Hardham, 2013; Zhu, 2016)。微管蛋白通常以基因家族的形式參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育(楊洪等, 2017)。自1963年首次從植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)微管蛋白(Ledbetteretal., 1963)以來(lái)，在模式物種擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Kopczaketal., 1992; Snustadetal., 1992)、水稻(Oryzasativa)(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)、毛果楊(Populustrichocarpa)(Rodneyetal., 2007)等多物種中開(kāi)展了微管蛋白研究，微管蛋白在細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及細(xì)胞壁的形成過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用(Mckeanetal., 2001)。研究證明，小麥(Triticumaestivum)微管在高爾基體的排列及其結(jié)構(gòu)完整性方面起著關(guān)鍵作用(Wangetal., 2012)，陸地棉(Gossypiumhirsutum)的GhTUB7對(duì)纖維細(xì)胞次生壁的合成具有調(diào)控作用(曾志鋒, 2016)，這些成果為研究竹子微管蛋白提供了良好的借鑒。

竹子具有速生的特點(diǎn)，能在2個(gè)月左右的時(shí)間迅速完成竹株的增高生長(zhǎng)，材性?xún)?yōu)良，4年能達(dá)到材性最佳，因此對(duì)于竹材材性形成的相關(guān)分子調(diào)控研究倍受關(guān)注。已報(bào)道了木質(zhì)素生物合成基因COMT(李雪平等, 2007)、PePAL1(高志民等, 2009)、C4H(金順玉等, 2010) 和PeLAC(李利超等, 2017)等的表達(dá)模式，證明了PePAL1、BoPAL2、BoPAL4表達(dá)的蛋白具有PAL/TAL雙重活性(Hsiehetal., 2010; Gaoetal., 2012)。竹子纖維素合成涉及的酶基因PpCesA1(杜亮亮等, 2010)、PeCesA(鄧小波等, 2011)、BeCesA1和BeCesA7(羅丹等, 2019)等的表達(dá)分析和木聚糖合成相關(guān)基因PeIRX10(王杰等, 2016)的功能分析也有研究報(bào)道。而竹子微管蛋白相關(guān)研究?jī)H有毛竹(Phyllostachysedulis)PeTUA3原核表達(dá)的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其可能參與毛竹細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞壁的形成過(guò)程(李彩麗等, 2012)。隨著毛竹基因組草圖以及基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的完成(Pengetal., 2013； Zhaoetal., 2014； 趙廣枝等, 2015)，為全面了解毛竹中微管蛋白基因提供了便利。本文以毛竹為研究對(duì)象，采用生物信息學(xué)的方法對(duì)微管蛋白基因的結(jié)構(gòu)特征、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和組織特異性表達(dá)等進(jìn)行了系統(tǒng)分析； 采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，分析了毛竹微管蛋白基因在不同發(fā)育階段毛竹筍中的表達(dá)模式； 同時(shí)采用在模式植物擬南芥中異位表達(dá)的方法，對(duì)PeTUA3的功能進(jìn)行了初步研究。以期為深入研究毛竹微管蛋白基因奠定基礎(chǔ)，為全面揭示毛竹筍快速生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

春季毛竹發(fā)筍期，赴江西南昌采集不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的筍(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 m)，樣品經(jīng)液氮處理后，置于-80 ℃冰箱中，用于RNA的提取。

擬南芥野生型(Col-0)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，播種于1/2MS培養(yǎng)基中，春化2天后轉(zhuǎn)入人工氣候室(溫度25～30 ℃、濕度60%～80%、光照時(shí)間16 h)，8天左右移栽到營(yíng)養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖體積比為7∶2∶1)中繼續(xù)培養(yǎng)4～5周，用于轉(zhuǎn)基因侵染試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛竹微管蛋白基因的獲取及理化性質(zhì)分析 以擬南芥微管蛋白基因AtTUA1(AT1G64740)和AtTUB1(AT1G75780)作為誘餌，在植物基因數(shù)據(jù)庫(kù)PLAZA(https:∥bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)(Proostetal., 2014)中進(jìn)行同源比對(duì)，獲取毛竹中微管蛋白基因的同源序列。篩選編碼微管蛋白含有該家族標(biāo)志性氨基酸保守區(qū)域“GGGTGSG”的基因，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守結(jié)構(gòu)域分析軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，保留具有完整保守結(jié)構(gòu)域的微管蛋白基因。

通過(guò)在線(xiàn)軟件GSDS Version 2.0(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制毛竹微管蛋白基因結(jié)構(gòu)，用MEME(http:∥meme-suite.org/tools/meme)和ExPaSy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)分別分析毛竹微管蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和基本理化性質(zhì)，用WOLF PSORT(https:∥www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)微管蛋白的亞細(xì)胞位置。

1.2.2 毛竹微管蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 基于MEGA 7.0內(nèi)置的Clustal W對(duì)毛竹、水稻和擬南芥的微管蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Kumaretal., 2016)，參數(shù)選擇： 鄰接法(Neighbor-Joining)，分支可信度檢測(cè)(Bootstrap method)為1 000次重復(fù)，氨基酸替換模型選用p-distance模型(Jonesetal., 1992)，缺失位點(diǎn)處理方法選擇完全刪除(complete deletion)。

1.2.3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的毛竹微管蛋白基因的表達(dá)譜分析 根據(jù)已發(fā)表的毛竹7個(gè)不同組織(葉、早花期花序、盛花期花序、鞭、根、20 cm筍、50 cm筍)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Pengetal., 2013)，篩選出毛竹微管蛋白基因在不同組織中的RPKM(reads per kilobases per million reads)值。采用Heml 1.0軟件繪制基因表達(dá)熱圖，用藍(lán)到紅漸變的顏色變化表示表達(dá)豐度的遞增。

1.2.4 cDNA的合成與實(shí)時(shí)定量PCR 通過(guò)TRIzol 法(Gaoetal., 2006)提取不同高度筍樣品以及轉(zhuǎn)正義PeTUA3和野生型擬南芥不同組織(根、莖、葉和花)的總RNA，殘余DNA使用Recombinant DNase I除去，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國(guó))操作說(shuō)明合成cDNA，分別用于定量分析以及基因克隆。

根據(jù)獲得的毛竹微管蛋白基因同源序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合適的定量引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。利用qTOWER 2.2(Analytik Jena, 德國(guó)) PCR儀進(jìn)行微管蛋白基因表達(dá)的定量分析，以PeNTB(Fanetal., 2013)為內(nèi)參，分析不同高度筍中微管蛋白基因的表達(dá)量； 以擬南芥AtActin-7(劉凱歌等, 2017)為內(nèi)參，定量分析轉(zhuǎn)基因擬南芥中PeTUA3表達(dá)情況。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系(10 μL)為： LightCycler?480 SYBR Green I Master Mix(Roche, 美國(guó))5.0 μL，正、反向引物各0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，共39個(gè)循環(huán)。定量數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-△△CT算法(Livaketal., 2001)分析，利用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪圖。

1.2.5PeTUA3表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 根據(jù)獲得的毛竹PeTUA3基因(FP100535.1) CDS序列，設(shè)計(jì)編碼區(qū)引物(ORF-TUA3)(表1)，以毛竹cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 40 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后用膠回收試劑盒(Biomiga, 中國(guó))回收，并連接到pGEM-T easy(Promega, 美國(guó))載體上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，篩選抗性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證，同時(shí)送生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 PCR引物①Tab.1 Primers sequences of PCR

根據(jù)PeTUA3的CDS序列和表達(dá)載體pBI121的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正義表達(dá)引物(STUA3)和反義表達(dá)引物(ATUA3)，以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，用正義表達(dá)引物和反義表達(dá)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，再酶切分別連接到表達(dá)載體pBI121的多克隆位點(diǎn)，形成表達(dá)載體。將表達(dá)載體質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105中，用于擬南芥轉(zhuǎn)化。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性篩選與表型分析 分別用含有正、反義PeTUA3表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序(Cloughetal., 1998)，暗處理48 h后正常培養(yǎng)，成熟后收集T0代種子。種子經(jīng)連續(xù)抗性篩選，得到T3代不分離的轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)試驗(yàn)。采用CTAB法(Clarke, 2009)提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板，以O(shè)RF-TUA3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，同時(shí)以野生型擬南芥為對(duì)照。分別播種正、反義轉(zhuǎn)PeTUA3基因和野生型種子于1/2MS培養(yǎng)基，在垂直板上生長(zhǎng)，相同條件下培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況并拍照，同時(shí)跟蹤測(cè)定各植株主根的生長(zhǎng)量，每次至少統(tǒng)計(jì)30株主根的根長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹微管蛋白基因序列和基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)比對(duì)分析，共獲得18條具有完整保守結(jié)構(gòu)域的毛竹微管蛋白基因，根據(jù)模式植物擬南芥同源基因相似度和命名規(guī)則，將其分別命名為PeTUA1-PeTUA6和PeTUB1-PeTUB12。基因結(jié)構(gòu)分析表明，TUA亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)差異較大，其中PeTUA2、PeTUA3和PeTUA6均含有3個(gè)內(nèi)含子，PeTUA1和PeTUA4含有4個(gè)內(nèi)含子，PeTUA5的內(nèi)含子最多，為8個(gè)； TUB亞家族成員均含有2～3個(gè)內(nèi)含子，其中PeTUB5與PeTUB8、PeTUB1與PeTUB4以及PeTUB3與PeTUB9的內(nèi)含子、外顯子長(zhǎng)度和位置分別大致相同(圖1A)。蛋白基序分析表明，毛竹微管蛋白屬于高度保守性蛋白，共獲得14個(gè)保守基序，基序1～10和基序12為18個(gè)毛竹微管蛋白共有基序，而基序13僅在TUA亞家族成員中出現(xiàn)，基序11和基序14只在TUB亞家族成員中出現(xiàn)(圖1B)。

圖1 毛竹微管蛋白基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Gene structures and conserved domains of tubulins in Moso bamboo

2.2 毛竹微管蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

毛竹微管蛋白家族成員的氨基酸個(gè)數(shù)為430～634個(gè)不等，分子量在48.31～69.89 kDa之間，其中除了PeTUA5(69.89 kDa)之外，其他各成員間分子量相差不大，均在50.00 kDa左右。根據(jù)微管蛋白各家族成員的等電點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果可知微管蛋白家族成員均為酸性蛋白，其等電點(diǎn)均在4.68～5.98之間，其中TUA亞家族成員的等電點(diǎn)略高于TUB亞家族成員。從平均疏水系數(shù)(GRAVY)結(jié)果可以看出，18個(gè)毛竹微管蛋白均為親水性蛋白，其中TUA亞家族成員GRAVY值在-0.162～-0.192之間，而TUB亞家族除PeTUB10為-0.168之外，其他亞家族成員GRAVY值均在-0.360左右。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，TUA亞家族均定位在細(xì)胞質(zhì)中，而TUB亞家族則均定位在細(xì)胞核中。

2.3 毛竹微管蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于毛竹、水稻、擬南芥微管蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，所有微管蛋白家族成員分別聚類(lèi)到2個(gè)亞家族(TUA和TUB)中(圖2)。其中TUA亞家族有2個(gè)分支A-1和A-2，在每個(gè)分支中，所有毛竹TUA亞家族成員均與水稻的聚類(lèi)在較近的位置。TUB亞家族有4個(gè)分支，其中B-1分支中包括7個(gè)毛竹TUB蛋白和3個(gè)水稻TUB蛋白，僅有1個(gè)擬南芥TUB蛋白AtTUB6； 而B(niǎo)-2分支只含有1個(gè)毛竹(PeTUB2)和1個(gè)水稻(OsTUB2)的TUB蛋白，包括4個(gè)擬南芥TUB蛋白； 在B-3分支中，包含4個(gè)毛竹TUB蛋白、3個(gè)水稻TUB蛋白和2個(gè)擬南芥TUB蛋白； B-4中僅包含2個(gè)擬南芥TUB蛋白。在各個(gè)分支中，毛竹微管蛋白和水稻的聚類(lèi)在較近的位置，而與擬南芥的相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.4 毛竹微管蛋白基因組織特異性表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)譜熱圖(圖3)可以看出，毛竹微管蛋白基因在7個(gè)組織中的表達(dá)量存在一定的差異。其中PeTUA3、PeTUA6、PeTUB2、PeTUB3、PeTUB7和PeTUB96個(gè)基因在各個(gè)組織中均有較高的表達(dá)量，它們可能作為組成型基因在毛竹整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用；PeTUA1、PeTUB1和PeTUB113個(gè)基因在根、筍和鞭中的表達(dá)量高于葉和花序中，表明這些基因可能主要與結(jié)構(gòu)組織發(fā)育相關(guān)；PeTUB6、PeTUB8和PeTUB10在根和鞭中的表達(dá)量高于其他組織，表明這些基因可能與地下組織形成有關(guān)；PeTUA2和PeTUB12在各組織中的表達(dá)量均比較低； 而PeTUA4在花序中表達(dá)量相對(duì)高于其他組織，說(shuō)明PeTUA4可能與花發(fā)育相關(guān)(圖3)。毛竹微管蛋白基因在不同組織中的表達(dá)差異，說(shuō)明它們?cè)诿癫煌M織中或同一組織的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段發(fā)揮著不同的功能。

圖2 基于毛竹和模式植物(水稻、擬南芥)微管蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of tubulin proteins from Moso bamboo and model plants(Oryza sativa and Arabidopsis thaliana)Pe: 毛竹 Phyllostachys edulis; Os: 水稻 Oryza sativa; At: 擬南芥 Arabidopsis thaliana.

圖3 微管蛋白基因在毛竹7個(gè)組織中的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of tubulin genes in seven tissues of Moso bambooLe： 葉； Ei： 早花期花序； Fi： 盛花期花序； Rh： 鞭； Ro： 根； S1： 20 cm筍； S2： 50 cm筍。Le: Leaf; Ei: Early inflorescence; Fi: Flowering inflorescence; Rh: Rhizome; Ro: Root; S1: 20 cm shoot; S2: 50 cm shoot.

2.5 毛竹微管蛋白基因在筍中的表達(dá)模式分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，隨著筍高度的增加TUA亞家族6個(gè)基因的表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，而TUB亞家族有8個(gè)基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，4個(gè)基因的表達(dá)為波動(dòng)變化(圖4)。在上調(diào)表達(dá)的基因中，PeTUA4、PeTUB3、PeTUB4、PeTUB9和PeTUB105個(gè)基因的表達(dá)量呈一直上升的趨勢(shì)；PeTUA1、PeTUA5、PeTUA6和PeTUB124個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在1.0 m和2.0 m筍中表達(dá)量相對(duì)較低，在6.0 m筍中表達(dá)量達(dá)到最高，之后在8.0 m筍中略微下降；PeTUA2、PeTUB5和PeTUB7的表達(dá)量呈現(xiàn)呈先上升后下降，再上升再下降的趨勢(shì)。在表達(dá)波動(dòng)變化的基因中，PeTUB1的表達(dá)先呈現(xiàn)下調(diào)，至4.0 m筍中達(dá)到最低，之后在6.0 m筍中表達(dá)量迅速上調(diào)達(dá)到最高，之后在8.0 m筍中又迅速下降，但仍然高于1.0 m筍中的表達(dá)量；PeTUB6在2.0 m筍中的表達(dá)量迅速上調(diào)(約是1.0 m筍中的2.8倍)，而在4.0 m筍中又迅速下降(約為1.0 m筍中的0.6倍)，之后又逐漸上升，8.0 m筍中約是1.0 m筍中的2.0倍；PeTUB8和PeTUB11都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在4.0 m和2.0 m筍中表達(dá)量最高，均是在8.0 m筍中最低(低于1.0 m筍中的表達(dá)量)。綜合來(lái)看，毛竹各微管蛋白基因在不同高度筍的表達(dá)模式存在著明顯差異，表明它們?cè)诠S的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。

圖4 微管蛋白基因在毛竹不同發(fā)育階段筍中的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of tubulin genes in different height shoots of Moso bamboo圖中為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤； 星號(hào)表示t檢驗(yàn)結(jié)果，*表示差異顯著(P< 0.05)，**表示差異極顯著(P < 0.01)。Values are means ± standard error. The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels of the gene expression in different shoot heights according to Student’s t test.

2.6 PeTUA3表達(dá)載體驗(yàn)證及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型分析

引物ORF-TUA3擴(kuò)增的產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體后測(cè)序結(jié)果表明，插入片段為1 356 bp，與FP100535.1序列完全一致。對(duì)克隆到pBI121多克隆位點(diǎn)的PeTUA3表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果表明，正義表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)插入序列依次包含XbaⅠ位點(diǎn)(6 bp)、PeTUA3編碼區(qū)正向序列(1 356 bp，含終止密碼子)和KpnⅠ位點(diǎn)(6 bp)，反義表達(dá)載體插入序列依次包含XbaⅠ位點(diǎn)(6 bp)、PeTUA3編碼區(qū)反向序列(1 356 bp，含終止密碼子)和KpnⅠ位點(diǎn)(6 bp)，PeTUA3編碼區(qū)序列與FP100535.1序列完全一致，表明獲得了正確的植物表達(dá)載體。對(duì)轉(zhuǎn)化的擬南芥進(jìn)行抗性篩選，分別獲得正、反義PeTUA3轉(zhuǎn)基因T3代不分離株系各7個(gè)。分別隨機(jī)選取3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明轉(zhuǎn)正、反義PeTUA3植株和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(pGEM-T easy+PeTUA3)中均檢測(cè)到目的基因，而野生型植株中沒(méi)有(圖5B)，證明了轉(zhuǎn)基因植株的真實(shí)性。

對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在垂直板上正義表達(dá)的擬南芥植株生長(zhǎng)較快，主根生長(zhǎng)旺盛，且有一定的側(cè)根，葉片面積大于野生型植株； 而反義表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)受阻，主要表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)弱小，主根較短，側(cè)根多且短，葉片面積略小于野生型植株(圖6A)。跟蹤觀察測(cè)量轉(zhuǎn)基因擬南芥主根生長(zhǎng)狀況表明，在第3～5天，轉(zhuǎn)正、反義PeTUA3以及野生型擬南芥主根生長(zhǎng)狀況基本一致； 在第5天之后，轉(zhuǎn)正義PeTUA3和野生型生長(zhǎng)較快，平均生長(zhǎng)速率分別為6.0、5.5 mm·d-1，轉(zhuǎn)反義PeTUA3擬南芥生長(zhǎng)非常緩慢(僅為1.0 mm·d-1)，第8天之后生長(zhǎng)幾乎停滯(圖6B)。

圖5 PeTUA3表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株檢測(cè)Fig.5 Expression vectors of PeTUA3 and the detection of transgenic Arabidopsis plantsA： 正、反義表達(dá)載體； B： PCR檢測(cè)(1-3： 轉(zhuǎn)基因正義植株； 4-6： 轉(zhuǎn)基因反義植株； 7： 野生型對(duì)照； 8： 質(zhì)粒DNA對(duì)照； M： DNA分子量標(biāo)記)。A: Sense and antisense expression vectors; B: Detected by PCR(1-3: Sense transgenic plants; 4-6: Antisense transgenic plants; 7: Wild-type control; 8: Plasmid DNA control; M: DNA molecular weight marker).

圖6 轉(zhuǎn)PeTUA3基因擬南芥植株表型分析Fig.6 Phenotype analysis of PeTUA3 transgenic Arabidopsis plantsA： 培養(yǎng)10天植株的表型(a： 野生型 Col-0; b： 正義; c： 反義)； B： 主根長(zhǎng)度變化。A: Phenotype of plants cultivated for 10 d(a: Wild type Clo-0; b: Sense; c: Antisense); B: Length changes of the main roots.

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥不同組織中PeTUA3的定量表達(dá)分析

在轉(zhuǎn)正義基因擬南芥植株的根、莖、葉和花序組織中，PeTUA3均有表達(dá)，其中以根中的表達(dá)量最高，其次是花序和莖，在葉片中的表達(dá)量最低； 在野生型中則是花序中最高，葉片中次之，根和莖相似，均比較低，但所有組織中的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株的組織(圖7)。轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖、葉、花中，PeTUA3的表達(dá)量分別約是野生型的6 400倍、1 700倍、190倍和300倍，均達(dá)到差異極顯著水平(P< 0.01)。

圖7 PeTUA3在轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of PeTUA3 in transgenic and wild type of Arabidopsis thalianaRo： 根； St： 莖； Le： 葉； Fl： 花。圖中為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤； 星號(hào)表示t檢驗(yàn)結(jié)果，**表示差異極顯著(P < 0.01)。Ro: Root; St: Stem; Le: Leaf; Fl: Flower. Values are means ± standard error. The double stars indicate significant difference at 0.01 level of the gene expression in different tissues according to Student’s t test.

3 討論

隨著木材供給不足，市場(chǎng)需求增加，竹材在一定程度上可以替代部分木材，被廣泛運(yùn)用于建材、家具以及生活工藝品等各個(gè)方面(江澤慧, 2002)，因此人們對(duì)竹材的形成與調(diào)控給予了高度關(guān)注。微管蛋白是植物細(xì)胞骨架的重要組成部分，指導(dǎo)細(xì)胞壁的生物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，間接影響植物的機(jī)械強(qiáng)度以及材性。雖然對(duì)植物微管蛋白的研究起步較早，在包括擬南芥(Kopczaketal., 1992; Snustadetal., 1992)、水稻(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)、毛果楊(Oakleyetal., 2007)和陸地棉(Whittakeretal., 1999; Heetal., 2008)等多種植物中得到開(kāi)展，而對(duì)于毛竹微管蛋白的研究相對(duì)較少。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷提高，基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的完善與豐富，為毛竹微管蛋白成員的基因結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)提供了很好的基礎(chǔ)(江澤慧, 2012)。本研究基于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)毛竹微管蛋白基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)模式進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)PeTUA3的功能進(jìn)行初步研究，結(jié)果對(duì)于揭示微管蛋白基因在毛竹快速生長(zhǎng)和優(yōu)良材性中的作用具有重要的參考價(jià)值。

不同物種中微管蛋白的數(shù)量存在著一定的差異，如TUA蛋白和TUB蛋白在擬南芥中分別為6個(gè)(Kopczaketal., 1992)和9個(gè)(Snustadetal., 1992)，水稻中分別為4個(gè)和8個(gè)(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)，毛果楊中分別為8個(gè)和20個(gè)(Oakleyetal., 2007)。本研究在毛竹中共鑒定出18條微管蛋白(6個(gè)TUA和12個(gè)TUB)，基因結(jié)構(gòu)和基序分析發(fā)現(xiàn)，雖然TUA亞家族和TUB亞家族成員之間存在一定的差異，但大多都包含共有的保守基序，表明毛竹微管蛋白在功能上是保守的。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，毛竹微管蛋白2個(gè)亞家族成員分別聚類(lèi)到6個(gè)亞組中，這與前人研究(Oakleyetal., 2007;饒國(guó)棟等, 2015)一致，其中有5對(duì)在進(jìn)化樹(shù)中以成對(duì)的形式出現(xiàn)，說(shuō)明它們可能來(lái)自串聯(lián)重復(fù)序列的復(fù)制(Meagheretal., 2003; 饒國(guó)棟等, 2015)。而且毛竹微管蛋白均與水稻的聚類(lèi)在較近的位置，表明在進(jìn)化過(guò)程中毛竹與水稻的親緣關(guān)系較近(Pengetal., 2013)，聚類(lèi)在一起的成員可能具有相似的功能。利用生物信息學(xué)方法對(duì)毛竹微管蛋白基因的篩選和分析，對(duì)于了解毛竹微管蛋白基本特征具有重要價(jià)值，為進(jìn)一步深入研究其功能提供了參考依據(jù)。

基因的表達(dá)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要表現(xiàn)形式之一。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，不同微管蛋白基因在毛竹不同組織中表達(dá)量各不相同，對(duì)它們?cè)诓煌叨裙S中的定量表達(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)了它們時(shí)空表達(dá)的差異性，表明它們?cè)诓煌M織中發(fā)揮功能存在一定的差異。TUA亞家族所有成員以及TUB亞家族中的8個(gè)基因均隨著毛竹筍高度的增加表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)這些基因在筍快速生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮著重要作用； 而TUB亞家族的其他4個(gè)基因在筍的生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)量表現(xiàn)為波動(dòng)趨勢(shì)。不同基因隨筍的生長(zhǎng)而表現(xiàn)出的差異表達(dá)的原因還有待于更深入的研究來(lái)揭示。過(guò)量表達(dá)PeTUA3能夠影響擬南芥生長(zhǎng)，尤其是對(duì)根系，轉(zhuǎn)正義基因植株主根明顯增長(zhǎng)，而反義的主根明顯變短。轉(zhuǎn)反義PeTUA3擬南芥的主根在第5天后生長(zhǎng)速度明顯減緩，這與轉(zhuǎn)反義擬南芥TUA6的表型(Baoetal., 2001) 相類(lèi)似。另外，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，正義擬南芥不同組織中PeTUA3的表達(dá)量顯著提高，尤其根中最高，這與主根生長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)的表型相一致。推測(cè)PeTUA3在毛竹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著類(lèi)似的促進(jìn)作用，通過(guò)促進(jìn)根系的生長(zhǎng)來(lái)提高養(yǎng)分吸收而實(shí)現(xiàn)快速生長(zhǎng)，但對(duì)于其在毛竹中的具體功能還需要進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)證明。

4 結(jié)論

本研究從毛竹中獲得18個(gè)微管蛋白基因，包含TUA亞家族成員6個(gè)(PeTUA1-PeTUA6)和TUB亞家族成員12個(gè)(PeTUB1-PeTUB12)，其基因結(jié)構(gòu)存在著一定的差異。毛竹微管蛋白屬于比較保守的蛋白，18個(gè)微管蛋白共有的保守基序?yàn)?1個(gè)。各微管蛋白基因在毛竹不同組織以及不同發(fā)育階段筍中的表達(dá)模式不盡相同，表明各基因功能的發(fā)揮具有差異性和時(shí)空性。在擬南芥中正義表達(dá)PeTUA3能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)，而反義表達(dá)PeTUA3則抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)，表明PeTUA3對(duì)毛竹的快速生長(zhǎng)可能具有重要的作用。