朱成磊 李彩麗 李曉佩 史晶晶 高志民

(1. 國際竹藤中心 國家林業(yè)和草原局/北京竹藤科學與技術重點開放實驗室 北京 100102； 2. 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所 北京 100193)

微管、微絲和中間纖維組成細胞骨架，其中微管的基本組成單位是微管二聚體，主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白通過共價鍵作用形成的中空管狀結構(Downingetal., 1998)。微管在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，不僅參與細胞分裂(Rasmussenetal., 2013)、細胞形態(tài)建成及維持(Burketal., 2002; Krtkováetal., 2016)，還參與指導細胞壁物質(zhì)的合成(Catteronetal., 2001)，通過影響細胞壁的組分和結構調(diào)控細胞的伸長(Paredezetal., 2006; Gutierrezetal., 2009)，而且在植物生物和非生物脅迫下，微管同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用(Hardham, 2013; Zhu, 2016)。微管蛋白通常以基因家族的形式參與調(diào)控植物的生長發(fā)育(楊洪等, 2017)。自1963年首次從植物細胞中發(fā)現(xiàn)微管蛋白(Ledbetteretal., 1963)以來，在模式物種擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Kopczaketal., 1992; Snustadetal., 1992)、水稻(Oryzasativa)(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)、毛果楊(Populustrichocarpa)(Rodneyetal., 2007)等多物種中開展了微管蛋白研究，微管蛋白在細胞的分裂、生長、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸及細胞壁的形成過程中均發(fā)揮著重要作用(Mckeanetal., 2001)。研究證明，小麥(Triticumaestivum)微管在高爾基體的排列及其結構完整性方面起著關鍵作用(Wangetal., 2012)，陸地棉(Gossypiumhirsutum)的GhTUB7對纖維細胞次生壁的合成具有調(diào)控作用(曾志鋒, 2016)，這些成果為研究竹子微管蛋白提供了良好的借鑒。

竹子具有速生的特點，能在2個月左右的時間迅速完成竹株的增高生長，材性優(yōu)良，4年能達到材性最佳，因此對于竹材材性形成的相關分子調(diào)控研究倍受關注。已報道了木質(zhì)素生物合成基因COMT(李雪平等, 2007)、PePAL1(高志民等, 2009)、C4H(金順玉等, 2010) 和PeLAC(李利超等, 2017)等的表達模式，證明了PePAL1、BoPAL2、BoPAL4表達的蛋白具有PAL/TAL雙重活性(Hsiehetal., 2010; Gaoetal., 2012)。竹子纖維素合成涉及的酶基因PpCesA1(杜亮亮等, 2010)、PeCesA(鄧小波等, 2011)、BeCesA1和BeCesA7(羅丹等, 2019)等的表達分析和木聚糖合成相關基因PeIRX10(王杰等, 2016)的功能分析也有研究報道。而竹子微管蛋白相關研究僅有毛竹(Phyllostachysedulis)PeTUA3原核表達的報道，發(fā)現(xiàn)其可能參與毛竹細胞分裂、細胞生長以及細胞壁的形成過程(李彩麗等, 2012)。隨著毛竹基因組草圖以及基因組數(shù)據(jù)庫的完成(Pengetal., 2013； Zhaoetal., 2014； 趙廣枝等, 2015)，為全面了解毛竹中微管蛋白基因提供了便利。本文以毛竹為研究對象，采用生物信息學的方法對微管蛋白基因的結構特征、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細胞定位、系統(tǒng)進化關系和組織特異性表達等進行了系統(tǒng)分析； 采用實時定量PCR方法，分析了毛竹微管蛋白基因在不同發(fā)育階段毛竹筍中的表達模式； 同時采用在模式植物擬南芥中異位表達的方法，對PeTUA3的功能進行了初步研究。以期為深入研究毛竹微管蛋白基因奠定基礎，為全面揭示毛竹筍快速生長的調(diào)節(jié)機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

春季毛竹發(fā)筍期，赴江西南昌采集不同生長發(fā)育階段的筍(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 m)，樣品經(jīng)液氮處理后，置于-80 ℃冰箱中，用于RNA的提取。

擬南芥野生型(Col-0)種子由本實驗室保存，播種于1/2MS培養(yǎng)基中，春化2天后轉入人工氣候室(溫度25～30 ℃、濕度60%～80%、光照時間16 h)，8天左右移栽到營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖體積比為7∶2∶1)中繼續(xù)培養(yǎng)4～5周，用于轉基因侵染試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛竹微管蛋白基因的獲取及理化性質(zhì)分析 以擬南芥微管蛋白基因AtTUA1(AT1G64740)和AtTUB1(AT1G75780)作為誘餌，在植物基因數(shù)據(jù)庫PLAZA(https:∥bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)(Proostetal., 2014)中進行同源比對，獲取毛竹中微管蛋白基因的同源序列。篩選編碼微管蛋白含有該家族標志性氨基酸保守區(qū)域“GGGTGSG”的基因，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的保守結構域分析軟件進行結構域驗證，保留具有完整保守結構域的微管蛋白基因。

通過在線軟件GSDS Version 2.0(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制毛竹微管蛋白基因結構，用MEME(http:∥meme-suite.org/tools/meme)和ExPaSy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)分別分析毛竹微管蛋白的保守結構域和基本理化性質(zhì)，用WOLF PSORT(https:∥www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)在線軟件預測微管蛋白的亞細胞位置。

1.2.2 毛竹微管蛋白系統(tǒng)進化樹的構建 基于MEGA 7.0內(nèi)置的Clustal W對毛竹、水稻和擬南芥的微管蛋白氨基酸序列進行比對，使用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹(Kumaretal., 2016)，參數(shù)選擇： 鄰接法(Neighbor-Joining)，分支可信度檢測(Bootstrap method)為1 000次重復，氨基酸替換模型選用p-distance模型(Jonesetal., 1992)，缺失位點處理方法選擇完全刪除(complete deletion)。

1.2.3 基于轉錄組數(shù)據(jù)的毛竹微管蛋白基因的表達譜分析 根據(jù)已發(fā)表的毛竹7個不同組織(葉、早花期花序、盛花期花序、鞭、根、20 cm筍、50 cm筍)的轉錄組數(shù)據(jù)(Pengetal., 2013)，篩選出毛竹微管蛋白基因在不同組織中的RPKM(reads per kilobases per million reads)值。采用Heml 1.0軟件繪制基因表達熱圖，用藍到紅漸變的顏色變化表示表達豐度的遞增。

1.2.4 cDNA的合成與實時定量PCR 通過TRIzol 法(Gaoetal., 2006)提取不同高度筍樣品以及轉正義PeTUA3和野生型擬南芥不同組織(根、莖、葉和花)的總RNA，殘余DNA使用Recombinant DNase I除去，按照反轉錄試劑盒(Promega, 美國)操作說明合成cDNA，分別用于定量分析以及基因克隆。

根據(jù)獲得的毛竹微管蛋白基因同源序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計合適的定量引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。利用qTOWER 2.2(Analytik Jena, 德國) PCR儀進行微管蛋白基因表達的定量分析，以PeNTB(Fanetal., 2013)為內(nèi)參，分析不同高度筍中微管蛋白基因的表達量； 以擬南芥AtActin-7(劉凱歌等, 2017)為內(nèi)參，定量分析轉基因擬南芥中PeTUA3表達情況。每個反應3個重復。反應體系(10 μL)為： LightCycler?480 SYBR Green I Master Mix(Roche, 美國)5.0 μL，正、反向引物各0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。反應程序： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，共39個循環(huán)。定量數(shù)據(jù)結果采用2-△△CT算法(Livaketal., 2001)分析，利用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行分析并繪圖。

1.2.5PeTUA3表達載體構建及農(nóng)桿菌轉化 根據(jù)獲得的毛竹PeTUA3基因(FP100535.1) CDS序列，設計編碼區(qū)引物(ORF-TUA3)(表1)，以毛竹cDNA為模板進行PCR擴增。反應程序： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 40 s，35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后用膠回收試劑盒(Biomiga, 中國)回收，并連接到pGEM-T easy(Promega, 美國)載體上，熱激轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞(DH5α)，篩選抗性克隆，提取質(zhì)粒并酶切驗證，同時送生工生物工程技術服務有限公司測序。

表1 PCR引物①Tab.1 Primers sequences of PCR

根據(jù)PeTUA3的CDS序列和表達載體pBI121的多克隆位點，設計正義表達引物(STUA3)和反義表達引物(ATUA3)，以測序正確的質(zhì)粒為模板，用正義表達引物和反義表達引物分別進行擴增。經(jīng)測序驗證后，再酶切分別連接到表達載體pBI121的多克隆位點，形成表達載體。將表達載體質(zhì)粒分別電擊轉入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105中，用于擬南芥轉化。

1.2.6 轉基因擬南芥抗性篩選與表型分析 分別用含有正、反義PeTUA3表達載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序(Cloughetal., 1998)，暗處理48 h后正常培養(yǎng)，成熟后收集T0代種子。種子經(jīng)連續(xù)抗性篩選，得到T3代不分離的轉基因植株用于后續(xù)試驗。采用CTAB法(Clarke, 2009)提取轉基因擬南芥的基因組DNA為模板，以ORF-TUA3引物進行PCR擴增驗證，同時以野生型擬南芥為對照。分別播種正、反義轉PeTUA3基因和野生型種子于1/2MS培養(yǎng)基，在垂直板上生長，相同條件下培養(yǎng)，觀察生長情況并拍照，同時跟蹤測定各植株主根的生長量，每次至少統(tǒng)計30株主根的根長。

2 結果與分析

2.1 毛竹微管蛋白基因序列和基因結構分析

通過比對分析，共獲得18條具有完整保守結構域的毛竹微管蛋白基因，根據(jù)模式植物擬南芥同源基因相似度和命名規(guī)則，將其分別命名為PeTUA1-PeTUA6和PeTUB1-PeTUB12。基因結構分析表明，TUA亞家族成員的基因結構差異較大，其中PeTUA2、PeTUA3和PeTUA6均含有3個內(nèi)含子，PeTUA1和PeTUA4含有4個內(nèi)含子，PeTUA5的內(nèi)含子最多，為8個； TUB亞家族成員均含有2～3個內(nèi)含子，其中PeTUB5與PeTUB8、PeTUB1與PeTUB4以及PeTUB3與PeTUB9的內(nèi)含子、外顯子長度和位置分別大致相同(圖1A)。蛋白基序分析表明，毛竹微管蛋白屬于高度保守性蛋白，共獲得14個保守基序，基序1～10和基序12為18個毛竹微管蛋白共有基序，而基序13僅在TUA亞家族成員中出現(xiàn)，基序11和基序14只在TUB亞家族成員中出現(xiàn)(圖1B)。

圖1 毛竹微管蛋白基因結構與保守結構域Fig.1 Gene structures and conserved domains of tubulins in Moso bamboo

2.2 毛竹微管蛋白理化性質(zhì)分析及亞細胞定位預測

毛竹微管蛋白家族成員的氨基酸個數(shù)為430～634個不等，分子量在48.31～69.89 kDa之間，其中除了PeTUA5(69.89 kDa)之外，其他各成員間分子量相差不大，均在50.00 kDa左右。根據(jù)微管蛋白各家族成員的等電點預測結果可知微管蛋白家族成員均為酸性蛋白，其等電點均在4.68～5.98之間，其中TUA亞家族成員的等電點略高于TUB亞家族成員。從平均疏水系數(shù)(GRAVY)結果可以看出，18個毛竹微管蛋白均為親水性蛋白，其中TUA亞家族成員GRAVY值在-0.162～-0.192之間，而TUB亞家族除PeTUB10為-0.168之外，其他亞家族成員GRAVY值均在-0.360左右。亞細胞定位預測分析結果表明，TUA亞家族均定位在細胞質(zhì)中，而TUB亞家族則均定位在細胞核中。

2.3 毛竹微管蛋白的系統(tǒng)進化分析

基于毛竹、水稻、擬南芥微管蛋白的系統(tǒng)進化分析結果表明，所有微管蛋白家族成員分別聚類到2個亞家族(TUA和TUB)中(圖2)。其中TUA亞家族有2個分支A-1和A-2，在每個分支中，所有毛竹TUA亞家族成員均與水稻的聚類在較近的位置。TUB亞家族有4個分支，其中B-1分支中包括7個毛竹TUB蛋白和3個水稻TUB蛋白，僅有1個擬南芥TUB蛋白AtTUB6； 而B-2分支只含有1個毛竹(PeTUB2)和1個水稻(OsTUB2)的TUB蛋白，包括4個擬南芥TUB蛋白； 在B-3分支中，包含4個毛竹TUB蛋白、3個水稻TUB蛋白和2個擬南芥TUB蛋白； B-4中僅包含2個擬南芥TUB蛋白。在各個分支中，毛竹微管蛋白和水稻的聚類在較近的位置，而與擬南芥的相對較遠。

2.4 毛竹微管蛋白基因組織特異性表達分析

基于轉錄組數(shù)據(jù)的表達譜熱圖(圖3)可以看出，毛竹微管蛋白基因在7個組織中的表達量存在一定的差異。其中PeTUA3、PeTUA6、PeTUB2、PeTUB3、PeTUB7和PeTUB96個基因在各個組織中均有較高的表達量，它們可能作為組成型基因在毛竹整個生長發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用；PeTUA1、PeTUB1和PeTUB113個基因在根、筍和鞭中的表達量高于葉和花序中，表明這些基因可能主要與結構組織發(fā)育相關；PeTUB6、PeTUB8和PeTUB10在根和鞭中的表達量高于其他組織，表明這些基因可能與地下組織形成有關；PeTUA2和PeTUB12在各組織中的表達量均比較低； 而PeTUA4在花序中表達量相對高于其他組織，說明PeTUA4可能與花發(fā)育相關(圖3)。毛竹微管蛋白基因在不同組織中的表達差異，說明它們在毛竹不同組織中或同一組織的不同生長發(fā)育階段發(fā)揮著不同的功能。

圖2 基于毛竹和模式植物(水稻、擬南芥)微管蛋白氨基酸序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of tubulin proteins from Moso bamboo and model plants(Oryza sativa and Arabidopsis thaliana)Pe: 毛竹 Phyllostachys edulis; Os: 水稻 Oryza sativa; At: 擬南芥 Arabidopsis thaliana.

圖3 微管蛋白基因在毛竹7個組織中的表達分析Fig.3 Expression analysis of tubulin genes in seven tissues of Moso bambooLe： 葉； Ei： 早花期花序； Fi： 盛花期花序； Rh： 鞭； Ro： 根； S1： 20 cm筍； S2： 50 cm筍。Le: Leaf; Ei: Early inflorescence; Fi: Flowering inflorescence; Rh: Rhizome; Ro: Root; S1: 20 cm shoot; S2: 50 cm shoot.

2.5 毛竹微管蛋白基因在筍中的表達模式分析

實時熒光定量PCR結果表明，隨著筍高度的增加TUA亞家族6個基因的表達量均呈上調(diào)趨勢，而TUB亞家族有8個基因的表達量呈上調(diào)趨勢，4個基因的表達為波動變化(圖4)。在上調(diào)表達的基因中，PeTUA4、PeTUB3、PeTUB4、PeTUB9和PeTUB105個基因的表達量呈一直上升的趨勢；PeTUA1、PeTUA5、PeTUA6和PeTUB124個基因表達趨勢均呈先上升后下降的趨勢，均在1.0 m和2.0 m筍中表達量相對較低，在6.0 m筍中表達量達到最高，之后在8.0 m筍中略微下降；PeTUA2、PeTUB5和PeTUB7的表達量呈現(xiàn)呈先上升后下降，再上升再下降的趨勢。在表達波動變化的基因中，PeTUB1的表達先呈現(xiàn)下調(diào)，至4.0 m筍中達到最低，之后在6.0 m筍中表達量迅速上調(diào)達到最高，之后在8.0 m筍中又迅速下降，但仍然高于1.0 m筍中的表達量；PeTUB6在2.0 m筍中的表達量迅速上調(diào)(約是1.0 m筍中的2.8倍)，而在4.0 m筍中又迅速下降(約為1.0 m筍中的0.6倍)，之后又逐漸上升，8.0 m筍中約是1.0 m筍中的2.0倍；PeTUB8和PeTUB11都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在4.0 m和2.0 m筍中表達量最高，均是在8.0 m筍中最低(低于1.0 m筍中的表達量)。綜合來看，毛竹各微管蛋白基因在不同高度筍的表達模式存在著明顯差異，表明它們在筍的生長過程中發(fā)揮著不同的作用。

圖4 微管蛋白基因在毛竹不同發(fā)育階段筍中的表達分析Fig.4 Expression analysis of tubulin genes in different height shoots of Moso bamboo圖中為平均值±標準誤； 星號表示t檢驗結果，*表示差異顯著(P< 0.05)，**表示差異極顯著(P < 0.01)。Values are means ± standard error. The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels of the gene expression in different shoot heights according to Student’s t test.

2.6 PeTUA3表達載體驗證及轉基因擬南芥植株表型分析

引物ORF-TUA3擴增的產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體后測序結果表明，插入片段為1 356 bp，與FP100535.1序列完全一致。對克隆到pBI121多克隆位點的PeTUA3表達載體測序結果表明，正義表達載體多克隆位點插入序列依次包含XbaⅠ位點(6 bp)、PeTUA3編碼區(qū)正向序列(1 356 bp，含終止密碼子)和KpnⅠ位點(6 bp)，反義表達載體插入序列依次包含XbaⅠ位點(6 bp)、PeTUA3編碼區(qū)反向序列(1 356 bp，含終止密碼子)和KpnⅠ位點(6 bp)，PeTUA3編碼區(qū)序列與FP100535.1序列完全一致，表明獲得了正確的植物表達載體。對轉化的擬南芥進行抗性篩選，分別獲得正、反義PeTUA3轉基因T3代不分離株系各7個。分別隨機選取3個轉基因株系進行PCR驗證，結果表明轉正、反義PeTUA3植株和陽性對照質(zhì)粒(pGEM-T easy+PeTUA3)中均檢測到目的基因，而野生型植株中沒有(圖5B)，證明了轉基因植株的真實性。

對T3代轉基因植株進一步觀察發(fā)現(xiàn)，在垂直板上正義表達的擬南芥植株生長較快，主根生長旺盛，且有一定的側根，葉片面積大于野生型植株； 而反義表達的轉基因植株生長受阻，主要表現(xiàn)為植株生長弱小，主根較短，側根多且短，葉片面積略小于野生型植株(圖6A)。跟蹤觀察測量轉基因擬南芥主根生長狀況表明，在第3～5天，轉正、反義PeTUA3以及野生型擬南芥主根生長狀況基本一致； 在第5天之后，轉正義PeTUA3和野生型生長較快，平均生長速率分別為6.0、5.5 mm·d-1，轉反義PeTUA3擬南芥生長非常緩慢(僅為1.0 mm·d-1)，第8天之后生長幾乎停滯(圖6B)。

圖5 PeTUA3表達載體及轉基因擬南芥植株檢測Fig.5 Expression vectors of PeTUA3 and the detection of transgenic Arabidopsis plantsA： 正、反義表達載體； B： PCR檢測(1-3： 轉基因正義植株； 4-6： 轉基因反義植株； 7： 野生型對照； 8： 質(zhì)粒DNA對照； M： DNA分子量標記)。A: Sense and antisense expression vectors; B: Detected by PCR(1-3: Sense transgenic plants; 4-6: Antisense transgenic plants; 7: Wild-type control; 8: Plasmid DNA control; M: DNA molecular weight marker).

圖6 轉PeTUA3基因擬南芥植株表型分析Fig.6 Phenotype analysis of PeTUA3 transgenic Arabidopsis plantsA： 培養(yǎng)10天植株的表型(a： 野生型 Col-0; b： 正義; c： 反義)； B： 主根長度變化。A: Phenotype of plants cultivated for 10 d(a: Wild type Clo-0; b: Sense; c: Antisense); B: Length changes of the main roots.

2.7 轉基因擬南芥不同組織中PeTUA3的定量表達分析

在轉正義基因擬南芥植株的根、莖、葉和花序組織中，PeTUA3均有表達，其中以根中的表達量最高，其次是花序和莖，在葉片中的表達量最低； 在野生型中則是花序中最高，葉片中次之，根和莖相似，均比較低，但所有組織中的表達量均遠低于對應的轉基因植株的組織(圖7)。轉基因擬南芥的根、莖、葉、花中，PeTUA3的表達量分別約是野生型的6 400倍、1 700倍、190倍和300倍，均達到差異極顯著水平(P< 0.01)。

圖7 PeTUA3在轉基因擬南芥和野生型擬南芥中的相對表達量Fig.7 Relative expression level of PeTUA3 in transgenic and wild type of Arabidopsis thalianaRo： 根； St： 莖； Le： 葉； Fl： 花。圖中為平均值±標準誤； 星號表示t檢驗結果，**表示差異極顯著(P < 0.01)。Ro: Root; St: Stem; Le: Leaf; Fl: Flower. Values are means ± standard error. The double stars indicate significant difference at 0.01 level of the gene expression in different tissues according to Student’s t test.

3 討論

隨著木材供給不足，市場需求增加，竹材在一定程度上可以替代部分木材，被廣泛運用于建材、家具以及生活工藝品等各個方面(江澤慧, 2002)，因此人們對竹材的形成與調(diào)控給予了高度關注。微管蛋白是植物細胞骨架的重要組成部分，指導細胞壁的生物合成和細胞生長，間接影響植物的機械強度以及材性。雖然對植物微管蛋白的研究起步較早，在包括擬南芥(Kopczaketal., 1992; Snustadetal., 1992)、水稻(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)、毛果楊(Oakleyetal., 2007)和陸地棉(Whittakeretal., 1999; Heetal., 2008)等多種植物中得到開展，而對于毛竹微管蛋白的研究相對較少。隨著現(xiàn)代生物技術的不斷提高，基因組和轉錄組數(shù)據(jù)的完善與豐富，為毛竹微管蛋白成員的基因結構和功能預測提供了很好的基礎(江澤慧, 2012)。本研究基于基因組和轉錄組數(shù)據(jù)對毛竹微管蛋白基因結構及其表達模式進行分析，同時對PeTUA3的功能進行初步研究，結果對于揭示微管蛋白基因在毛竹快速生長和優(yōu)良材性中的作用具有重要的參考價值。

不同物種中微管蛋白的數(shù)量存在著一定的差異，如TUA蛋白和TUB蛋白在擬南芥中分別為6個(Kopczaketal., 1992)和9個(Snustadetal., 1992)，水稻中分別為4個和8個(Eonetal., 2000; Oshikawaetal., 2003)，毛果楊中分別為8個和20個(Oakleyetal., 2007)。本研究在毛竹中共鑒定出18條微管蛋白(6個TUA和12個TUB)，基因結構和基序分析發(fā)現(xiàn)，雖然TUA亞家族和TUB亞家族成員之間存在一定的差異，但大多都包含共有的保守基序，表明毛竹微管蛋白在功能上是保守的。系統(tǒng)進化分析表明，毛竹微管蛋白2個亞家族成員分別聚類到6個亞組中，這與前人研究(Oakleyetal., 2007;饒國棟等, 2015)一致，其中有5對在進化樹中以成對的形式出現(xiàn)，說明它們可能來自串聯(lián)重復序列的復制(Meagheretal., 2003; 饒國棟等, 2015)。而且毛竹微管蛋白均與水稻的聚類在較近的位置，表明在進化過程中毛竹與水稻的親緣關系較近(Pengetal., 2013)，聚類在一起的成員可能具有相似的功能。利用生物信息學方法對毛竹微管蛋白基因的篩選和分析，對于了解毛竹微管蛋白基本特征具有重要價值，為進一步深入研究其功能提供了參考依據(jù)。

基因的表達是其發(fā)揮生物學功能的重要表現(xiàn)形式之一。根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)得到的組織特異性表達結果表明，不同微管蛋白基因在毛竹不同組織中表達量各不相同，對它們在不同高度筍中的定量表達分析進一步證實了它們時空表達的差異性，表明它們在不同組織中發(fā)揮功能存在一定的差異。TUA亞家族所有成員以及TUB亞家族中的8個基因均隨著毛竹筍高度的增加表達量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，推測這些基因在筍快速生長時期發(fā)揮著重要作用； 而TUB亞家族的其他4個基因在筍的生長過程中表達量表現(xiàn)為波動趨勢。不同基因隨筍的生長而表現(xiàn)出的差異表達的原因還有待于更深入的研究來揭示。過量表達PeTUA3能夠影響擬南芥生長，尤其是對根系，轉正義基因植株主根明顯增長，而反義的主根明顯變短。轉反義PeTUA3擬南芥的主根在第5天后生長速度明顯減緩，這與轉反義擬南芥TUA6的表型(Baoetal., 2001) 相類似。另外，進一步對轉基因擬南芥中基因表達檢測結果表明，正義擬南芥不同組織中PeTUA3的表達量顯著提高，尤其根中最高，這與主根生長明顯增長的表型相一致。推測PeTUA3在毛竹生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著類似的促進作用，通過促進根系的生長來提高養(yǎng)分吸收而實現(xiàn)快速生長，但對于其在毛竹中的具體功能還需要進一步試驗來證明。

4 結論

本研究從毛竹中獲得18個微管蛋白基因，包含TUA亞家族成員6個(PeTUA1-PeTUA6)和TUB亞家族成員12個(PeTUB1-PeTUB12)，其基因結構存在著一定的差異。毛竹微管蛋白屬于比較保守的蛋白，18個微管蛋白共有的保守基序為11個。各微管蛋白基因在毛竹不同組織以及不同發(fā)育階段筍中的表達模式不盡相同，表明各基因功能的發(fā)揮具有差異性和時空性。在擬南芥中正義表達PeTUA3能夠促進轉基因擬南芥的生長，而反義表達PeTUA3則抑制轉基因擬南芥的生長，表明PeTUA3對毛竹的快速生長可能具有重要的作用。