蘇佳露 史無雙 楊雅運(yùn) 王 星 丁雨龍 林樹燕

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210037； 2. 南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所 南京210037； 3. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 南京 210037)

植物在自然生長(zhǎng)和人工栽培過程中常會(huì)發(fā)生葉色變異。植物葉色變異通常是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠素積累異常所導(dǎo)致，而葉綠素的合成、降解涉及葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育、光形態(tài)建成以及葉綠體-核之間的信號(hào)傳導(dǎo)等(何冰等, 2006)。在復(fù)雜的葉綠素合成過程中，一個(gè)或多個(gè)基因的功能異常，均可能影響葉綠素的積累、運(yùn)輸和代謝，從而導(dǎo)致葉片表型顏色的異常(Eckhardtetal., 2004)。Nakanishi等(2005)對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)pcb2突變白化苗鑒定分析后發(fā)現(xiàn)，5號(hào)染色體18 660處發(fā)生單核苷酸替換，導(dǎo)致二乙烯基原葉綠素衍生物8-乙烯基還原酶異常，從而導(dǎo)致二乙烯基葉綠素含量降低。Wu等(2011)將水稻(Oryzasativa)白化G9突變體與廣湛63S進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，G9突變體可逆的白化性狀是由11號(hào)染色體上的隱性基因clbGZ控制。而Wang等(2017)在白色條紋wsl4突變體水稻中發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因組中的wsl4序列2 bp的缺失，導(dǎo)致其編碼的P家族PPR蛋白功能缺陷，使得葉綠素含量降低，葉綠體結(jié)構(gòu)異常。Kubicka等(2007)在研究黑麥(Secalecereale)白條紋突變體后，發(fā)現(xiàn)tys基因突變導(dǎo)致葉綠素a和b含量降低，致使葉片出現(xiàn)黃色條紋性狀。植物部分葉片發(fā)生葉色變異，會(huì)使葉片形成斑塊狀或條紋狀分區(qū)，這種葉片被稱為彩葉。

竹子是傳統(tǒng)的園林觀賞植物，彩葉竹種由于葉片上特有的白(黃)綠相間條紋，被大量引種栽培。目前關(guān)于竹類植物葉色變異的研究相對(duì)較少，如對(duì)烏腳綠竹(Bambusaedulis)、菲白竹(Pleioblastusfortunei)等組培白化突變體葉綠體基因表達(dá)(袁麗釵等, 2010; Linetal., 2006; 2008; Liuetal., 2007; Wuetal., 2009)；自然環(huán)境下生長(zhǎng)的花葉矢竹(Pseudosasajaponicaf.akebonosuji)和花葉唐竹(Sinobambusatootsikvar.luteoloalbostriata)各種顏色葉片光合特性、色素含量、葉綠體結(jié)構(gòu)及其相關(guān)葉色表型基因的分析(陳凌艷等, 2019; 成敏敏等, 2018; 姜可以, 2013; 楊海蕓, 2015; Jiangetal., 2016)； 幾種常見彩葉竹種不同葉色表型的顯微結(jié)構(gòu)觀察(王嘯晨, 2012)。對(duì)彩葉竹種葉片不同葉色分區(qū)的光合色素、顯微結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)的比較觀察尚未見報(bào)道。本研究以6種葉色變異竹種各生長(zhǎng)期葉片為材料，通過對(duì)6個(gè)彩葉竹種葉片白(黃)區(qū)與綠區(qū)的葉色和葉綠素及類胡蘿卜素含量測(cè)定、各發(fā)育階段葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察、成熟葉片不同分區(qū)超微結(jié)構(gòu)的比較，分析葉片不同分區(qū)表觀葉色、光合色素和解剖形態(tài)的差異，為探討彩葉竹種葉色變異機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 6種彩葉竹種： 七彩紅竹(Indosasahispida‘Rainbow’, IH)、菲白竹(PF)、靚竹(Sasaellaglabraf.albostriata, SG)、黃條金剛竹(S.kongosanensis‘Aureostriatus’, SK)、錦竹(Hibanobambusatranquillansf.shiroshima, HT)和花葉唐竹(Sinobambusatootsikvar.luteoloalbostriata, ST)均采自南京林業(yè)大學(xué)白馬苗圃繁育基地(119°10′35″E, 31°36′19″N)。2019年1月選取當(dāng)年生枝條中部完全舒展的健康功能條紋葉片； 2019年5月選取枝條頂部未舒展的幼葉。葉片條紋按顏色分為白色(黃色)部分(albino stripe, AS)和綠色部分(green stripe, GS)。

2) 光合色素含量測(cè)定 2019年1月采集的6個(gè)竹種植株完全舒展的健康功能葉片，采后立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后，將葉片按白色和綠色分割，各分區(qū)稱取葉片約0.1 g，研缽研磨，10 mL 80%的丙酮溶液提取24 h。Metash UV-5200紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定溶液470 nm、645和663 nm波長(zhǎng)處的吸光值。根據(jù)以下公式(Nayeketal., 2014)，計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的含量。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

Ca=(12.25A663-2.79A645)×V/(W×1 000)

Cb=(21.5A645-5.1A663) ×V/(W×1 000)

C(x+c)=[(1 000A470-1.82Ca-85.02Cb)/198] ×V/(W×1 000)。

式中，Ca、Cb、C(x+c)分別代表葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量(mg·g-1)，A為吸光值，V為提取液總體積(mL)，若稀釋則乘以相應(yīng)的倍數(shù)，W為葉片鮮質(zhì)量(g)。

3) 葉片光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察 未舒展葉片： 2019年5月，采集枝條頂部的未舒展葉片，置于70%FAA固定液(70%乙醇∶福爾馬林∶冰醋酸=90∶5∶5)中固定24 h，固定后剝離頂部卷曲葉片，按剝離層數(shù)由外至內(nèi)分為J3(長(zhǎng)度L>7 cm，卷曲，部分見光)、J2(L=2～4 cm，卷曲，未見光)、J1(L<1 cm，卷曲，未見光)，選擇卷曲葉片中部進(jìn)行切片。

舒展功能葉片： 2019年1月,采集植株中部完全舒展的健康功能葉片。固定后切取以主脈為中軸的10 mm×5 mm大小葉塊，轉(zhuǎn)置25%氫氟酸中軟化36～48 h。

采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)(李正理，1987)切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋， Leica RM 2255自動(dòng)切片機(jī)切片(厚度為8 μm)，番紅-固綠雙重染色法染色，中性樹膠封片，Leica DM 2500光學(xué)顯微鏡選取成熟葉片沿主脈左右對(duì)稱AS和GS區(qū)視野拍照觀察。Leica Application suite X軟件對(duì)沿主脈左右對(duì)稱AS和GS區(qū)葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度和葉肉層厚度進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)竹種葉片選取5個(gè)切片，每個(gè)切片選取白綠區(qū)各10個(gè)視野觀測(cè)，每個(gè)竹種測(cè)量50個(gè)數(shù)據(jù)。

4) 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察 參考Hall等(1991)的方法，觀察葉片葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。采集完全舒展的健康功能葉片，避開葉脈切取AS和GS區(qū)的三角形葉塊(底×高=1 mm×5 mm)，置于4%多聚甲醛和2%戊二醛混合固定液(pH7.0)中，抽氣使葉片下沉，4 ℃下固定24 h，磷酸緩沖液沖洗3次后，乙醇逐級(jí)脫水，丙酮置換，LR. white樹脂包埋，Leica EM UC6超薄切片機(jī)切片(切片厚度約為90 nm)，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在電子透射電鏡JEM-1400下拍照觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理 使用PASWStatistics18進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，利用Origin 8.5作圖，Excel 2016制表，圖表中所有數(shù)據(jù)值均為重復(fù)測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個(gè)竹種葉片AS區(qū)和GS區(qū)RGB像素值比較 RGB像素值反映葉片顏色。由圖1可知，每個(gè)竹種GS區(qū)像素值為G值>R值>B值，G值最大葉片表現(xiàn)出綠色。AS區(qū)各顏色像素值表現(xiàn)為R≈G>B，R與G值相互作用使葉片表現(xiàn)為黃色。七彩紅竹、菲白竹和花葉唐竹R/G≈1，而B值大小表現(xiàn)為菲白竹>花葉唐竹>七彩紅竹，因此菲白竹葉片AS區(qū)最白，其次是花葉唐竹、七彩紅竹，靚竹與錦竹R/G值和B值測(cè)算結(jié)果相似，葉片表現(xiàn)為淡黃色，黃條金剛竹R/G最大，且B值最小，表現(xiàn)為金黃色。以上結(jié)果表明，6個(gè)竹種GS區(qū)RGB值顯著低于AS區(qū)(P<0.05)。

圖1 6個(gè)竹種AS區(qū)與GS區(qū)RGB像素值比較Fig.1 Comparison of RGB pixel values of AS and GS of Leaves from 6 bamboo species紅綠藍(lán)色點(diǎn)代表相對(duì)應(yīng)的RGB像素值Red, green and blue coordinate points represent RGB pixel values。IH：七彩紅竹Indosasa hispida ‘Rainbow’；PF：菲白竹Pleioblastus fortunei；SG：靚竹Sasaella glabra f. albostriata； SK：黃條金剛竹 Sa. kogasensis ‘Aureostriatus’；HT：錦竹 Hibanobambusa tranquillans f. shiroshima； ST：花葉唐竹Sinobambusa tootsik var. luteoloalbostriata. AS:葉片白區(qū)Albino stripe； GS:葉片綠區(qū)Green stripe.下同。The same below.

2.2 6個(gè)竹種AS和GS光合色素水平差異 由圖2可知，七彩紅竹葉片AS區(qū)Chl a、Chl b和Car含量為GS的1.53%、0.53%、7.94%； 菲白竹為2.94%、3.81%、4.08%； 靚竹為0.68%、0.97%、13.05%； 黃條金剛竹為3.14%、12.9%、17.53%； 錦竹為0.29%、0.43%、5.7%； 花葉唐竹為0.5%、8.65%、0.99%。AS區(qū)靚竹、黃條金剛竹、錦竹和花葉唐竹Car含量顯著高于Chl a與Chl b(P<0.05)，黃條金剛竹AS區(qū)各類色素含量占GS比值最高，錦竹最低。除菲白竹外，AS區(qū)各竹種Chl a與Chl b含量無顯著性差異(圖2A)。除七彩紅竹外，各竹種GS區(qū)Chl a含量顯著高于Chl b與Car(P<0.05)，菲白竹與錦竹Chl b含量最低，七彩紅竹、靚竹、黃條金剛竹與花葉唐竹Car含量最低(圖2B)?？傊?，不同竹種AS與GS區(qū)色素含量不一。6個(gè)竹種中，葉片AS區(qū)的Chl a、Chl b和Car含量均顯著低于GS區(qū)(P<0.05)。

圖2 6個(gè)彩葉竹種葉片AS和GS光合色素含量比較Fig.2 Leaf photosynthetic pigment contents comparison of AS and GS from 6 bamboo species.A： 6個(gè)竹種AS區(qū)光合色素含量； B： 6個(gè)竹種GS區(qū)光合色素含量。A： Leaf photosynthetic pigment contents of AS from 6 bamboo species; B： Leaf photosynthetic pigment contents of GS from 6 bamboo species.

圖3 6個(gè)彩葉竹種不同生長(zhǎng)階段葉片AS和GS顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Leaf microstructure of AS and GS from 6 bamboo speciesa、b、c、d、e、f分別為6個(gè)彩葉竹種J1時(shí)期葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；g、h、i、j、k、l分別為6個(gè)彩葉竹種J2時(shí)期葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；m、n、o、p、q、r分別為6個(gè)彩葉竹種J3時(shí)期葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；s1、t1、u1、v1、w1、x1分別為6個(gè)彩葉竹種成熟葉片GS區(qū)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；s2、t2、u2、v2、w2、x2分別為6個(gè)彩葉竹種成熟葉片AS區(qū)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；J1-J3：幼嫩葉不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；ML：成熟葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)；UE：上表皮；LE：下表皮；mc：泡狀細(xì)胞；rc：梅花狀細(xì)胞；ac：指狀臂細(xì)胞；fc：梭型細(xì)胞；綠色箭頭指示GS區(qū)；紅色箭頭指示AS區(qū)；圖a-f和s-x標(biāo)尺大小為50 μm; 圖g-r標(biāo)尺大小為100 μm.a, b, c, d, e, and f are the leaves internal structure of 6 colorful-leaved bamboo species at J1 stage; g, h, i, j, k, and l are the leaves interior structure of 6 colorful-leaved bamboo species at J2 stage; m, n, o, p, q, r are the internal structure of the leaves of 6 colorful-leaved bamboo species at J3 stage; s1、t1、u1、v1、w1、x1 are the internal structure of GS region in mature leaves of 6 colored bamboo species; s2、t2、u2、v2、w2、x2 are the internal structure of AS region in mature leaves of 6 colored bamboo species; J1-J3： Internal structure of young leaves at different development stages；ML: Internal structure of mature leaves; UE: upper epidermis; LE: lower epidermis; mc: motor cell; rc: rosette cell; ac: arm cell; fc: fusoid cell; Green arrows show green stripe of leaf；Red arrows show albino stripe of leaf；scale bars: 50 μm in images a-f and s-x, 100 μm in images g-r.

2.3 6個(gè)竹種不同生長(zhǎng)階段葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察 由圖3可知，各竹種J1期組織分化程度低，細(xì)胞近正方形，細(xì)胞核大，未出現(xiàn)明顯區(qū)別于籜片的葉結(jié)構(gòu)，橫切片可見表皮系統(tǒng)，維管系統(tǒng)和基本組織系統(tǒng)分化(圖3a～f)。表皮由一層排列較規(guī)律的細(xì)胞組成，上下表皮之間無差異； 維管束位置聚集著一群細(xì)胞，它們排列成一個(gè)近圓形結(jié)構(gòu)，少數(shù)分化出一個(gè)類似導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，中脈維管最先出現(xiàn)，其后兩側(cè)分化出新的維管束； 基本組織細(xì)胞無序排列填充，各竹種之間無明顯結(jié)構(gòu)差異，未出現(xiàn)AS區(qū)與GS區(qū)。J2期各組織分化程度較高，各竹種之間結(jié)構(gòu)差異明顯(圖3g～l)。菲白竹、靚竹和錦竹葉片上下表皮出現(xiàn)角質(zhì)層加厚(圖3h，3i，3k)，各竹種上表皮對(duì)應(yīng)維管束之間位置分化出泡狀細(xì)胞，下表皮分化出氣孔器，表皮細(xì)胞出現(xiàn)乳突，表皮毛等結(jié)構(gòu)； 維管束分化出韌皮部、木質(zhì)部和維管束鞘，出現(xiàn)一級(jí)脈和二級(jí)脈分化且數(shù)量逐漸增加，主脈與各一級(jí)脈之間差異不明顯，兩側(cè)葉緣出現(xiàn)大泡狀細(xì)胞； 葉肉細(xì)胞出現(xiàn)不明顯的梅花狀細(xì)胞和指狀臂細(xì)胞的分化，七彩紅竹各維管束兩側(cè)均分化出梭型細(xì)胞(圖3g)，黃條金剛竹、錦竹和花葉唐竹出現(xiàn)少量梭型細(xì)胞(圖3j、3k、3l)，梭型細(xì)胞飽滿近圓形細(xì)胞核明顯，菲白竹與靚竹暫未出現(xiàn)梭型細(xì)胞(圖3h、3i)，葉肉細(xì)胞出現(xiàn)分層，6個(gè)竹種葉肉細(xì)胞未見明顯葉色分區(qū)。J3期各竹種發(fā)育狀態(tài)接近成熟(圖3m～r)。6個(gè)竹種上下表皮角質(zhì)層增厚，表皮部位各細(xì)胞分化完成，泡狀細(xì)胞輕微凸起； 橫切面上可見維管束分化出主脈、一級(jí)脈和二級(jí)脈，主脈維管束厚壁細(xì)胞增多并凸起，使主脈明顯區(qū)別于其他葉脈。各竹種葉肉細(xì)胞層數(shù)清晰，分化出明顯區(qū)別的指狀臂細(xì)胞、梅花狀細(xì)胞和梭型細(xì)胞，6個(gè)竹種梭型細(xì)胞細(xì)胞核消失，細(xì)胞呈現(xiàn)薄膜狀，葉肉細(xì)胞在染色上出現(xiàn)明顯的葉色分區(qū)，葉色分區(qū)為完全AS區(qū)、完全GS區(qū)以及不同層數(shù)細(xì)胞呈不同著色結(jié)果的混合區(qū)，AS區(qū)細(xì)胞無著色或少量著色，但形狀上與GS區(qū)細(xì)胞無明顯差異。因此，各竹種葉片幼期不同生長(zhǎng)階段其結(jié)構(gòu)存在明顯差異，隨著葉片發(fā)育，各類細(xì)胞形態(tài)陸續(xù)分化，葉片色區(qū)也明顯區(qū)分。

在對(duì)6個(gè)竹種成熟葉片組織進(jìn)行比對(duì)觀察，發(fā)現(xiàn)6個(gè)竹種AS與GS區(qū)葉肉細(xì)胞形態(tài)上無明顯差異，但細(xì)胞染色后的著色結(jié)果差異明顯(圖3s1-x1,3s2-x2)。染色后七彩紅竹與黃條金剛竹AS區(qū)細(xì)胞除細(xì)胞核外，其余部位無著色，細(xì)胞顯現(xiàn)內(nèi)容物缺失狀態(tài)(圖3s2、3u2)，菲白竹、靚竹、錦竹和花葉唐竹細(xì)胞染色淺，細(xì)胞內(nèi)有些零散內(nèi)容物著色，細(xì)胞整體上明顯區(qū)別于GS區(qū)(圖3t2、3u2、3w2、3x2)，6個(gè)竹種GS區(qū)細(xì)胞形態(tài)和排列方式各有不同，但GS區(qū)葉肉細(xì)胞染色后均表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)完整，內(nèi)容物飽滿的狀態(tài)。各部分指標(biāo)測(cè)量數(shù)據(jù)顯示GS與AS之間上下表皮無顯著性差異，七彩紅竹、菲白竹、靚竹和錦竹AS區(qū)葉片厚度和葉肉細(xì)胞厚度顯著性低于GS區(qū)，黃條金剛竹與花葉唐竹AS與GS區(qū)厚度無差別(表1)。

表1 6個(gè)彩葉竹種分區(qū)顯微結(jié)構(gòu)指標(biāo)①Tab.1 Microstructure data of AS and GS of Leaves from 6 bamboo species

2.4 6個(gè)竹種成熟功能葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異 在6個(gè)竹種AS區(qū)與GS區(qū)細(xì)胞內(nèi)部各細(xì)胞器形態(tài)存在差異(圖4)。成熟葉片GS區(qū)指狀臂細(xì)胞和梅花狀細(xì)胞內(nèi)有大量的完整葉綠體(圖4a～l)，位置緊靠著細(xì)胞壁發(fā)育占據(jù)了葉肉細(xì)胞內(nèi)部大量的空間。竹類植物的葉綠體為橢圓形，但由于細(xì)胞壁的內(nèi)折，葉綠體的形態(tài)也發(fā)生形變。褶皺的細(xì)胞壁擴(kuò)大了細(xì)胞表面積，也為葉綠體的發(fā)育提供空間。GS區(qū)葉綠體形態(tài)完整，體態(tài)豐滿，幼嫩葉綠體內(nèi)有多而大的淀粉粒，成熟的葉綠體開始出現(xiàn)少量嗜鋨顆粒。6個(gè)竹種的GS區(qū)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)都較為完整，各細(xì)胞器清晰可見(圖4m～r)，AS區(qū)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別與GS區(qū)，均無完整葉綠體結(jié)構(gòu)(圖4s-ad)。七彩紅竹AS區(qū)細(xì)胞內(nèi)部空洞、各細(xì)胞器解體(圖4s)，靠近細(xì)胞壁處有少數(shù)橢圓形質(zhì)體，質(zhì)體內(nèi)外膜破裂，有許多小囊泡和嗜鋨顆粒堆積(圖4y)。菲白竹AS區(qū)細(xì)胞內(nèi)除葉綠體外各細(xì)胞器完整(圖4t)，靠近細(xì)胞壁部位存在扁平狀質(zhì)體，其內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，有狹長(zhǎng)的類囊體片層，無垛疊的類囊體基粒，質(zhì)體內(nèi)部有少量脂質(zhì)小球和嗜鋨顆粒(圖4z)。靚竹細(xì)胞核完整，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器較少，細(xì)胞空洞(圖4u)，靠近細(xì)胞壁部位有長(zhǎng)柱形質(zhì)體，質(zhì)體內(nèi)外膜缺失，聚集許多絮狀碎片，內(nèi)部有少量小囊泡狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量小的嗜鋨顆粒(圖4aa)。黃條金剛竹AS區(qū)內(nèi)部較空洞，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整(圖4v)，細(xì)胞內(nèi)部有圓形質(zhì)體，質(zhì)體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部有聚集大而多的囊泡狀結(jié)構(gòu)，囊泡周圍有分布許多嗜鋨顆粒(圖4ab)。錦竹細(xì)胞核位于細(xì)胞中部，少量細(xì)胞器和質(zhì)體靠近細(xì)胞壁分布(圖4 w)，質(zhì)體近圓形，外膜完整，內(nèi)部破解存在許多破解碎片，有小而多的囊泡聚集，大量的嗜鋨顆粒分布在其周圍(圖4ac)?；ㄈ~唐竹與菲白竹一樣，細(xì)胞內(nèi)部各細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整(圖4x)，靠近細(xì)胞壁部位有長(zhǎng)條形質(zhì)體，質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)完整內(nèi)部有片層狀類囊體但未見類囊體基粒堆積。以上結(jié)果表明，葉綠體結(jié)構(gòu)是否完整是造成竹葉葉片有黃白條紋的主要原因。

圖4 6個(gè)彩葉竹種成熟葉片AS和GS超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure comparison of AS and GS from 6 bamboo speciesa、b、c、d、e、f分別為6個(gè)彩葉竹種葉片綠區(qū)的梅花狀葉肉細(xì)胞；g、h、i、j、k、l分別為6個(gè)彩葉竹種葉片綠區(qū)的指狀臂細(xì)胞；m、n、o、p、q、r分別為6個(gè)彩葉竹種葉片綠區(qū)的葉綠體；s、t、u、v、w、x分別為6個(gè)彩葉竹種葉片白區(qū)的葉肉細(xì)胞；y、z、aa、ab.ac.ad分別為6個(gè)彩葉竹種葉片白區(qū)的異常葉綠體。CN：細(xì)胞核；Ch：葉綠體；G：基粒；S：淀粉粒；OG：嗜餓顆粒。a, b, c, d, e, and f are the rosette-shaped mesophyll cells of the leaves GS region in 6 colorful-leaved bamboos; g, h, i, j, k, and l are the arm mesophyll cells of the leaves GS region in these 6 bamboos; m, n, o, p, q, and r are the chloroplasts of the leaves GS region in these 6 bamboos; s, t, u, v, w and x are the mesophyll cells of the leaves AS region in these 6 bamboos; y, z, aa, ab,ac and ad are the abnormal chloroplasts of the leaves AS region in these 6 bamboos.CN: Cell nucleus; Ch: Chloroplast; G: Granum; S: Starch grain; OG: Osmiophilic granule.

3 討論

3.1 葉片不同葉色區(qū)RGB像素值與光合色素含量之間的關(guān)系 葉片葉色的顯現(xiàn)，是因葉片中色素對(duì)不同波長(zhǎng)光譜的吸收和反射存在差異，葉綠素a主要吸收紅光和藍(lán)紫光，葉綠素b和類胡蘿卜素主要吸收藍(lán)紫光(王振興等， 2016)，因此葉片顏色的亮度像素值RGB與葉片中色素的含量之間存在一定的關(guān)系。Kawashima等(1998)就發(fā)現(xiàn)小麥和水稻不同時(shí)期葉色RGB像素值可用于估算葉片葉綠素含量(Kawashimaetal., 1998)，之后研究者們?cè)隈R鈴薯(Solanumtuberosumcv.benimaru)、早稻(Jinyou 458和Zhongjiazao 35)、眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)、桑(Morusalba)等植物中也發(fā)現(xiàn)RGB像素值與光合色素含量之間存在多種函數(shù)關(guān)系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)葉色RGB像素值還與葉片氮含量、脂質(zhì)含量和黃酮含量變化有關(guān)(Guptaetal., 2013; Louetal., 2012; Suetal., 2008; Yadavetal., 2010; Yietal., 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)AS區(qū)和GS區(qū)RGB值隨著光合色素含量變化而變化，結(jié)合葉色RGB與色素含量圖可知，各AS區(qū)Car含量最高的靚竹與黃條金剛竹中，葉片最黃，Chla與Car含量無顯著性差異的菲白竹表現(xiàn)為白色，AS區(qū)Car與RGB中B值大小成反比(r2=0.7)。葉色對(duì)葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的估算的規(guī)律在6個(gè)竹種中也適用，但若想確定兩者之間準(zhǔn)確的函數(shù)關(guān)系，還需進(jìn)行深入的研究。

3.2 葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和色素含量影響葉片葉色表型 自然界中的彩葉植物大體上有4種類型： 葉綠素型、色素型、表皮型和空隙型，其中表皮型與空隙型這2種由于葉片結(jié)構(gòu)的特殊性而引起的葉色變異被稱為結(jié)構(gòu)型變異(Hara, 1957)。由葉片結(jié)構(gòu)的特殊導(dǎo)致的葉片葉色分區(qū)現(xiàn)象十分常見，F(xiàn)ooshee等(1990)對(duì)多種雜色長(zhǎng)葉粗肋草(Aglanonemanitidum)進(jìn)行解剖觀察發(fā)現(xiàn)葉片表皮與葉肉細(xì)胞之間的大間隙引發(fā)光的反射，使得葉片白色斑塊的出現(xiàn)； 廣西落檐(Schismatoglottiscalyptrate)葉片白色斑塊的出現(xiàn)是由于柵欄組織細(xì)胞與表皮細(xì)胞底部的接觸程度差異是光發(fā)生折射導(dǎo)致的(Tsukayaetal., 2004)； 同樣發(fā)現(xiàn)秋海棠屬(Begonia)的葉色變異也是由于表皮細(xì)胞下存在大的細(xì)胞間隙引起的光的折射造成的(Sheueetal., 2012)。這類葉色變異是由于柵欄組織細(xì)胞之間或與表皮之間存在大空隙，使得入射光線在細(xì)胞之間發(fā)生漫射，進(jìn)而影響葉片的吸收光譜和反射光譜，產(chǎn)生葉色變異(王振興等， 2016)。通過對(duì)本文6個(gè)竹種4個(gè)發(fā)育時(shí)期的葉片顯微結(jié)構(gòu)的觀察和比較可知，6個(gè)竹種不同葉色分區(qū)顯微結(jié)構(gòu)之間無明顯差異，除皺縮的梭型細(xì)胞造成的細(xì)胞內(nèi)空腔，葉肉細(xì)胞之間、葉肉細(xì)胞與表皮細(xì)胞之間均排列緊密，因此這6個(gè)竹種黃白色條紋的出現(xiàn)與葉片表皮與細(xì)胞的排列方式無關(guān)。

葉片葉色變異類型中最多的為葉綠素型變異，即葉片細(xì)胞中葉綠素的含量減低引起的葉色變異。在對(duì)花燭品種Anthuriumandraeanum‘Sonate’，各種水稻、黑麥和擬南芥葉色突變體的變色機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，葉綠體結(jié)構(gòu)異常與葉綠素含量的差異是引起這些植物葉片產(chǎn)生葉色變異的原因(陳星旭, 2009;邱義蘭等, 2010; Chenetal., 2018;Wadaetal., 2009; Wangetal., 2017; Nakanishietal., 2005)。關(guān)于彩葉竹種葉色變異研究中均發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，陳柯伊等(2018)在對(duì)多種不同葉色矢竹葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)和光合系統(tǒng)特性差異研究中發(fā)現(xiàn)，葉綠體發(fā)育成熟度的不一致導(dǎo)致的光合色素積累的差異引發(fā)葉色變異現(xiàn)象； 成敏敏等(2018)在對(duì)花葉矢竹復(fù)綠過程中葉綠體結(jié)構(gòu)和光合特性研究中發(fā)現(xiàn)，類囊體片層的有序排列與光合色素的積累是葉片復(fù)綠的直接原因； 陳凌艷等(2017)對(duì)銀絲竹不同葉色分區(qū)內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)與光合色素含量的比較后，推測(cè)葉綠體結(jié)構(gòu)的異常與葉綠素合成受阻是銀絲竹條紋葉片形成的原因。本文對(duì)6個(gè)竹種各時(shí)期解剖結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)，黃條金剛竹J1、J2、J3期葉片葉綠體發(fā)育均正常，而成熟葉片AS區(qū)細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)容物缺失，葉綠體結(jié)構(gòu)異常，因此黃條金剛竹細(xì)胞AS區(qū)的出現(xiàn)是由于正常葉片內(nèi)葉綠體解體和葉綠素含量降解形成的，但這一結(jié)果與王嘯晨(2012)對(duì)黃條金剛竹顯微與超微觀察結(jié)果不同，主要原因是葉片采集時(shí)間的不同和葉片成熟度不同，使得葉片表現(xiàn)出不同的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。其他竹種葉片葉肉細(xì)胞分化的過程伴隨著葉綠體的結(jié)構(gòu)發(fā)育，在這一過程中AS區(qū)葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體非正常發(fā)育，出現(xiàn)片層化、解體狀的形態(tài)異常，這些異常使得這一部分葉片無法進(jìn)行正常的葉綠素積累，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白色條紋，這個(gè)結(jié)果與花葉矢竹的葉色變異機(jī)制和銀絲竹葉色結(jié)構(gòu)差異中的研究結(jié)論相似(陳凌艷， 2017； 楊海蕓， 2015)。

3.3 AS區(qū)出現(xiàn)的意義 6個(gè)竹種GS區(qū)葉綠體結(jié)構(gòu)和光合色素積累正常，內(nèi)部各細(xì)胞器豐富且結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞進(jìn)行正常的生理活動(dòng)并積累淀粉。而AS區(qū)葉綠體均發(fā)育異常，雖然質(zhì)體形態(tài)各有不同，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器生存狀態(tài)也不同，內(nèi)部養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)與物質(zhì)代謝途徑無法判斷是否受到影響，但這一部分細(xì)胞已經(jīng)無法進(jìn)行正常的光合作用與能量積累，且葉片細(xì)胞數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果顯示，七彩紅竹、菲白竹、靚竹和錦竹AS區(qū)葉肉細(xì)胞顯著小于GS區(qū)，AS區(qū)細(xì)胞發(fā)育遲緩，這與楊海蕓(2015)在花葉矢竹研究一致，目前研究人員猜測(cè)葉片白色條紋或斑塊的出現(xiàn)與葉片光破壞防御機(jī)制有關(guān)(周麗英等， 2016)，但現(xiàn)有研究未能明確這點(diǎn)，因此有關(guān)彩葉竹種條紋葉色的出現(xiàn)的生理學(xué)意義暫時(shí)未能明確。

4 結(jié)論

6個(gè)彩葉竹種葉片條紋葉色表型受葉片中一部分葉肉細(xì)胞的光合色素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)的影響，與葉片表皮及細(xì)胞排列無關(guān)。黃條金剛竹葉片在生長(zhǎng)后期出現(xiàn)黃色條紋，其余5個(gè)彩葉竹種則在葉片呈色過程中顯現(xiàn)白(黃)綠不規(guī)則交替條紋，這些條紋的出現(xiàn)均伴有較低的光合色素含量和葉綠體構(gòu)的異常。白色區(qū)中類胡蘿卜素的含量影響和比值關(guān)系影響白色條紋顏色，類胡蘿卜素含量比值較高的條紋呈現(xiàn)的黃色程度更深。