侯東升，張 靜，馮 麗，張晶晶，王 穎

0 引 言

熊果酸又稱(chēng)烏索酸，是一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物，以游離或結(jié)合成苷的形式廣泛存在于多種藥用植物中[1]，在鎮(zhèn)靜、抗炎、殺菌、降糖、抗?jié)兊确矫婢幸欢ㄗ饔肹2]。有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸在抑制 HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡方面效果顯著，能增強(qiáng)小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬能力[3]。其抗腫瘤作用也逐漸引起人們的重視。目前在抗乳腺癌、肝癌、胃癌等方面的研究得到廣泛開(kāi)展并取得了一定的研究進(jìn)展，已成為防治腫瘤的研究熱點(diǎn)。 本研究旨在探究熊果酸對(duì)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖、凋亡途徑方面的影響， 以期為甲狀腺癌的防治尋找一種新的可行性方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及細(xì)胞株熊果酸(索萊寶公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(澳洲AusGeneX公司)；二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(美國(guó)Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Gibco公司)；CCK8試劑盒(日本同仁公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢聯(lián)科生物公司)；JC-1試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，胰蛋白酶室溫消化3～5 min，加入適量培養(yǎng)液終止消化后離心收集細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為4000～6000個(gè)/mL，以每孔100 μL接種至96孔板，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，分別加入不含胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、2、4、8、16、32 μmol/L，其中以0 μmol/L為對(duì)照)，再以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24 h、48 h后終止培養(yǎng)，每孔加CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育2～4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 下的各孔吸光度(A)值，再根據(jù)所得到的吸光度值，細(xì)胞抑制率計(jì)算公式如下：

增殖抑制率=(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%

以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算藥物半抑制濃度(IC50)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞按6×104個(gè)/mL的濃度種植于無(wú)菌6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，更換無(wú)胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。用不含EDTA 胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)用Annexin V 及PI 標(biāo)記細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，TPC-1細(xì)胞凋亡率計(jì)算如下：

TPC-1細(xì)胞凋亡率=[細(xì)胞總凋亡率(%)=B2象限細(xì)胞比例(%)+ B4象限細(xì)胞比例(%)

1.4 JC-1試劑盒測(cè)線(xiàn)粒體膜電位將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞按6×104個(gè)/mL的濃度種植于無(wú)菌6孔板中培養(yǎng)， 當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，更換無(wú)胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)用JC-1染色緩沖液(1×)處理細(xì)胞。 采用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞。

1.5 活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平細(xì)胞內(nèi)活性氧的相對(duì)含量以 DCF的熒光強(qiáng)度表示。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞按6×104個(gè)/mL的濃度種植于無(wú)菌6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，更換無(wú)胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。將DCFH-DA試劑用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋1000倍至10 μmol/L，按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)用稀釋好的DCFH-DA試劑處理細(xì)胞。采用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞并拍照。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)蛋白表達(dá)將對(duì)數(shù)期細(xì)胞胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，加培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×104個(gè)/mL，接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至孔底70%～80%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，分別加入不含胎牛血清的不同濃度的熊果酸培養(yǎng)基(濃度分別為0、4、8 μmol/L)處理24 h。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心機(jī)(京立LDZ5-2型離心機(jī))1000 r/min，離心5 min，離心半徑15 cm。用75%冰乙醇將細(xì)胞固定20 min后離心，PBS洗兩遍。3% BSA封閉細(xì)胞1 h，每半小時(shí)混勻一次。將處理好的細(xì)胞離心，PBS洗一遍，計(jì)數(shù)細(xì)胞。按抗體使用說(shuō)明書(shū)加入比率一抗，做好陰性對(duì)照，室溫孵育1 h，每半小時(shí)混勻一次。再次離心細(xì)胞去除上清液，PBS洗滌兩遍。在光線(xiàn)較暗的房間用PBS按1∶1500比例稀釋熒光素標(biāo)記的二抗，每孔加150 μL，在暗室孵育1 h，每半小時(shí)混勻一次。離心細(xì)胞去上清，PBS洗一遍，加入150 μL的PBS混勻上機(jī)。 檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7RT-PCR法測(cè)mRNA的表達(dá)情況用熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞干預(yù)24h后，按提取試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞RNA；按反轉(zhuǎn)錄盒使用說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的各組RNA進(jìn)行處理，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，引物分別為：存活素上游：5′- GGACCACCGCATCTCTACATTC-3′,下游5′-CCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTC-3′,VEGF上游5′- GAGGCTCCAGGGCATT AGAC-3′,下游5′-TCACCAAGGCCAGCA CATAG-3′，GAPDH上游5′-GGAAGCTTG TCATCAATGGAAATC-3′，下游5′-TGATG ACCCTTTTGGCTCCC-3′；利用7500熒光定量PCR儀檢測(cè)各組細(xì)胞的存活素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) mRNA表達(dá)水平。

進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。不同時(shí)間點(diǎn)均值比較采用重復(fù)測(cè)量分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熊果酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響2、4、8、16、32 μmol/L熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞抑制率較0 μmol/L 明顯升高(P<0.01)；48 h時(shí)熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞抑制率較24 h明顯升高(P<0.05)。TPC-1細(xì)胞抑制率與熊果酸濃度及時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。24 h及48 h熊果酸的IC50分別為(13.46±0.45)μmol/L、(10.69±0.41)μmol/L。

表 1 不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞的抑制作用

2.2 熊果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L熊果酸的細(xì)胞凋亡率分別為(4.13±0.61)%、(6.53±0.65)%、(13.13±1.59)%，且隨熊果酸藥物濃度的增加，TPC-1細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P<0.05)。熊果酸可有效誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖1。

a:0 μmol/L;b:4 μmol/L;c:8 μmol/L

2.3熊果酸對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響熊果酸 0 μmol/L時(shí)顯示細(xì)胞有較強(qiáng)紅色熒光，未見(jiàn)綠色熒光，隨熊果酸藥物濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.4 熊果酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響隨熊果酸藥物濃度的增加，細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱，說(shuō)明隨熊果酸藥物濃度的增加，各濃度細(xì)胞中活性氧含量逐漸降低。見(jiàn)圖3。

圖示隨著熊果酸濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱

a:0 μmol/L;b:4 μmol/L;c:8 μmol/L

2.5 間接免疫熒光標(biāo)記法測(cè)細(xì)胞中存活素及VEGF的蛋白表達(dá)情況4、8 μmol/L熊果酸存活素、VEGF的蛋白相對(duì)表達(dá)量較0 μmol/L明顯降低(P<0.05)，8 μmol/L較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞所得熒光強(qiáng)度值

2.6 qRT-PCR法測(cè)細(xì)胞中存活素及VEGF mRNA的表達(dá)情況4、8 μmol/L熊果酸存活素 mRNA的表達(dá)(0.53±0.07、0.71±0.09)較0 μmol/L熊果酸(1.00±0.00)明顯降低(P<0.01)，8 μmol/L熊果酸較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。4、8 μmol/L熊果酸VEGF mRNA的表達(dá)量(0.68±0.04、0.42±0.07)較0 μmol/L熊果酸(1.00±0.00)明顯降低(P<0.01)，8 μmol/L熊果酸較4 μmol/L明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，屬分化型，惡性度較其他類(lèi)型低[4]，但對(duì)放化療不敏感，因此手術(shù)治療仍是目前最有效的治療方法[5]。近年來(lái)，甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率逐年上升，占甲狀腺癌發(fā)病率的90%以上[6]。 由于診斷水平的提高及診斷程序的改進(jìn)，使更小的腫瘤(尤其是微小乳頭狀癌)的檢測(cè)成為可能[7]，甲狀腺癌的年發(fā)病率在過(guò)去40年中幾乎增加了2倍[8-9]。甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展緩慢，臨床不適癥狀少見(jiàn)，因而其疾病性質(zhì)易被忽視。給予本病患者適當(dāng)手術(shù)干預(yù)及放射性碘治療，部分患者加用促甲狀腺激素抑制治療均可獲得良好預(yù)后。但本病早期易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，有報(bào)道稱(chēng)約40%～60%的甲狀腺乳頭狀癌病例在首診時(shí)已發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的復(fù)發(fā)率約是未轉(zhuǎn)移病例的6倍[10]。因而研究甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機(jī)制并探尋新的防治方法成為研究的熱點(diǎn)，如分子靶向治療、中醫(yī)藥治療等[11]。

熊果酸作為一種廣泛存在于果蔬中的天然物質(zhì)，近年來(lái)其抗腫瘤作用得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。目前與熊果酸及其衍生物相關(guān)抗腫瘤作用研究已涉及乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多個(gè)方面[12-15]，并取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。范源等[2]對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過(guò)多種細(xì)胞信號(hào)通路對(duì)腫瘤進(jìn)行抑制作用，包括對(duì)腫瘤形成細(xì)胞毒作用、抑制其增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并且在抗腫瘤細(xì)胞侵襲和抗腫瘤血管形成方面也具有一定作用。但其對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞有無(wú)作用及相關(guān)作用機(jī)制的研究暫未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究對(duì)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞進(jìn)行 熊果酸干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨熊果酸濃度的逐漸增加，TPC-1細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增大，說(shuō)明熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞增值具有一定的抑制作用。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果酸對(duì)TPC-1細(xì)胞的凋亡有無(wú)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨熊果酸濃度的增加，TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率逐漸增大，說(shuō)明熊果酸對(duì)促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡具有一定的作用。

惡變發(fā)生后，腫瘤組織生長(zhǎng)加速，需氧量增加，供氧血管需求增大。機(jī)體為適應(yīng)缺氧環(huán)境分泌多種生物因子來(lái)促進(jìn)血管生成。VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)血管生成以改善腫瘤組織缺氧方面起到關(guān)鍵性作用[16]。VEGF不僅在促進(jìn)腫瘤新生血管形成方面作用顯著，而且也是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的重要因素，因此VEGF已成為目前腫瘤診治的重要研究對(duì)象。VEGF和VEGFR抑制劑已在晚期腫瘤的治療中獲得重大突破。存活素是一種凋亡抑制蛋白，為凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein, IAP) 家族成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。 存活素具有抗凋亡、調(diào)控細(xì)胞分化增殖等作用。本研究采用間接免疫熒光標(biāo)記法及qRT-PCR法分別檢測(cè)TPC-1細(xì)胞中存活素及VEGF的蛋白和mRNA表達(dá)情況及隨藥物濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中存活素及VEGF 的蛋白及mRNA呈高表達(dá)，隨熊果酸藥物濃度的增高，存活素及VEGF的蛋白和 mRNA 的表達(dá)均逐漸降低，說(shuō)明熊果酸可有效抑制TPC-1細(xì)胞中存活素和VEGF的表達(dá)。Ma等[17]認(rèn)為VEGF 可上調(diào) 存活素 的表達(dá)。Mesri 等[18]認(rèn)為 存活素 是在VEGF介導(dǎo)下調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，且認(rèn)為VEGF的存在是存活素起調(diào)節(jié)血管生成作用的條件。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知熊果酸可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中存活素及VEGF的表達(dá)來(lái)影響TPC-1細(xì)胞的增殖及組織血管生成。

在腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，存活素的表達(dá)增強(qiáng)可進(jìn)一步抑制細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、Caspase-9的活化及凋亡活性物質(zhì)的釋放[19-20]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到內(nèi)部凋亡刺激因子的作用時(shí)，可誘發(fā)鈣超載、活性氧含量增加，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體跨膜電位降低甚至消失等現(xiàn)象[21]，造成線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔不可逆性開(kāi)放，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)等一系列變化的發(fā)生，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。本研究利用JC-1試劑盒及熒光探針DCFH-DA檢測(cè)熊果酸作用于TPC-1細(xì)胞后其線(xiàn)粒體膜電位變化及活性氧的變化情況。當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC-1在線(xiàn)粒體基質(zhì)中結(jié)合為紅色熒光的物質(zhì)；當(dāng)線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能參與聚集，此時(shí)為帶有綠色熒光JC-1單體物質(zhì)。所以我們可根據(jù)熒光的顏色來(lái)觀(guān)測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化情況，由實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)隨熊果酸濃度的增加TPC-1細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位逐漸降低，DCF的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。因此考慮熊果酸誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞的凋亡可能通過(guò)增加線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧含量，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降，進(jìn)而啟動(dòng)線(xiàn)粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但具體量化指標(biāo)及相關(guān)檢測(cè)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示熊果酸可通過(guò)抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中存活素及VEGF的表達(dá)，進(jìn)而有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及影響腫瘤組織的血管生成；其誘導(dǎo)凋亡途徑可能通過(guò)增加線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧含量，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降，進(jìn)而啟動(dòng)線(xiàn)粒體凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。