李敬，尤穎，呂惠麗，穆娟

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061)

銀杏(GinkgobilobaL.)被稱為植物界的“活化石”，是現(xiàn)今地球上最古老的樹種之一[1]。銀杏的葉和種仁中含有天然活性物質(zhì)黃酮及苦內(nèi)酯等多種成分，具有溶解膽固醇、擴(kuò)張血管的作用，對改善腦功能障礙、動脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、記憶力減退等有明顯效果[2,3]，其防病、治病的價值在我國古代就有記載，如《本草綱目》中詳解為：“銀杏，熟食溫肺、益氣、定喘嗽、縮小便、止白濁；生食降痰、消毒殺蟲”[4]。近年來，對銀杏化學(xué)成分、藥理成分及生產(chǎn)應(yīng)用的研究十分流行[5-7]。

黃酮類化合物是一類低分子天然植物成分，常作為抗菌劑、抗氧化劑及感光劑等[8]。銀杏葉中的黃酮類物質(zhì)不僅是一種比較理想的藥物，也是一類重要的保健食品功能因子，具有廣闊的應(yīng)用前景，是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。但目前黃酮的提取率普遍不高，提高銀杏葉黃酮化合物的提取率已成為進(jìn)行黃酮產(chǎn)品開發(fā)需要解決的關(guān)鍵問題。同時，開發(fā)利用黃酮類化合物的抑菌功效，可以為醫(yī)藥食品工業(yè)提供豐富的原料。因此，本文對銀杏葉黃酮的微波輔助提取工藝及其抑菌作用進(jìn)行了研究，對銀杏葉黃酮資源的開發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

銀杏葉：采自河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)校園；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥業(yè)生物制品檢定所；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無水乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖：均為分析純；瓊脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨：均為生化試劑。

1.2 試驗(yàn)儀器

微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；722可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；SHD-III型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銀杏葉黃酮提取工藝流程

原料(銀杏葉)→烘干→粉碎→過篩→稱量→浸提→微波處理→抽濾→脫色→濃縮→黃酮類化合物粗提物。

1.3.2 銀杏葉總黃酮得率的計算

式中：c為黃酮類化合物的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為銀杏葉干粉的質(zhì)量，g[9]。

1.3.3 銀杏葉黃酮抑菌效力的測定

采用濾紙片擴(kuò)散法測定抑菌圈[10]。

1.3.3.1 濾紙片的制備及處理

將濾紙剪成直徑為8 mm大小的圓片，置于試管中，塞上棉塞，高壓蒸汽滅菌后，放到銀杏葉提取液中浸泡，取出，瀝去多余藥液，直接貼入剛接種供試菌株的培養(yǎng)基上，以浸泡過無菌生理鹽水的濾紙片作對照。

1.3.3.2 接種培養(yǎng)

準(zhǔn)確吸取已經(jīng)配制好的菌懸液(大腸桿菌及金黃色葡萄球菌)0.1 mL加入已倒好的平板培養(yǎng)基中，涂布均勻，貼入處理好的濾紙片，每種菌2組培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，大腸桿菌于37 ℃培養(yǎng)1～2 d，金黃色葡萄球菌于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌長出后觀察是否有抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對銀杏葉總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末，每份1.000 g，置于錐形瓶中，按照1∶20 (g/mL)的料液比分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在480 W微波功率下處理15 s，計算銀杏葉總黃酮的得率，以黃酮得率為考察指標(biāo)。

由圖1可知，在固定料液比1∶20、輻射時間15 s、微波功率480 W條件下，隨著乙醇濃度的增加，黃酮得率增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時，黃酮類化合物的溶解度最大，得率也最高；而后，當(dāng)乙醇濃度再增加時，黃酮類化合物的溶解度降低，不利于提取，黃酮得率下降?？赡苁且?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，溶劑的極性隨之降低，使得提取環(huán)境不利于有極性的黃酮類化合物的溶出，從而造成提取率下降。

圖1 乙醇濃度對銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.2 料液比對銀杏葉總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末，每份1.000 g，置于錐形瓶中，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入濃度為80%的乙醇，在480 W微波功率下提取15 s，計算銀杏葉總黃酮的得率。

由圖2可知，在固定乙醇濃度80%、輻射時間15 s、微波功率480 W條件下，黃酮得率隨料液比從1∶10到1∶25逐漸增大，而從1∶25到1∶30逐漸下降?？赡苁窃谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量的增加有助于銀杏葉黃酮類化合物的浸出。溶劑用量太少，提取不太完全；但溶劑用量太大，微波加熱的負(fù)荷增大，達(dá)到提取完全所需要的時間也相應(yīng)增加，結(jié)果在限定時間(15 s)內(nèi)銀杏葉總黃酮得率反而下降。

圖2 料液比對銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.3 提取時間對銀杏葉總黃酮得率的影響

按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇，用480 W微波功率分別提取6，9，12，15，18 s。計算銀杏葉總黃酮的得率，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

由圖3可知，在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、微波功率480 W條件下，銀杏葉總黃酮得率與輻射時間并不呈現(xiàn)簡單的正比關(guān)系，15 s內(nèi)黃酮得率隨輻射時間延長呈上升趨勢，15 s以后開始下降，15 s時的得率最高，提取效果最好。原因可能是時間過短，黃酮提取不完全；時間過長，微波的強(qiáng)熱效應(yīng)又開始對黃酮產(chǎn)生分解作用，導(dǎo)致黃酮得率下降。

圖3 輻射時間對銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.4 微波功率對銀杏葉總黃酮得率的影響

按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇，在此條件下，分別用160，320，480，640，800 W微波功率處理15 s，計算銀杏葉總黃酮的得率。

由圖4可知，在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、輻射時間15 s條件下，隨著微波功率的升高，黃酮類化合物的得率增加；當(dāng)微波處理功率達(dá)到640 W時，總黃酮得率達(dá)到最大值；此時，如果繼續(xù)增大微波功率，總黃酮得率反而下降。原因可能是當(dāng)功率足夠高時，細(xì)胞內(nèi)溫度迅速升高，高溫使細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞空間膨脹的能力，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，同時也使得細(xì)胞內(nèi)黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，活性降低，從而造成總黃酮得率降低。

圖4 微波功率對銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.5 銀杏葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

影響微波法提取銀杏葉黃酮類化合物的因素主要是乙醇濃度、料液比、輻射時間、微波功率等，采用正交試驗(yàn)法確定微波提取銀杏葉黃酮類化合物的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，這4個因素的影響大小次序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>B(料液比)>C(輻射時間)>D(微波功率)。綜合考慮，得出的最佳提取工藝為A2B2C1D1，即乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時間為15 s、微波功率640 W。

表2 微波法提取銀杏葉黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method

續(xù) 表

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過正交試驗(yàn)結(jié)果，基本上確定了微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件，下面準(zhǔn)確稱量3份銀杏葉粉末，每份1.000 g，在最佳工藝條件(乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時間為15 s、微波功率640 W)下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，計算銀杏葉總黃酮的得率，以黃酮得率為考察指標(biāo)，以確定其可行性。

由表3可知，微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件重復(fù)性好，且黃酮得率高于正交表中的最大黃酮得率，因此確定微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳提取條件為：乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時間為15 s、微波功率640 W。在此條件下銀杏葉總黃酮得率為6.82%。

表3 最佳條件下微波法提取銀杏葉黃酮的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method under the optimal conditions

2.7 銀杏葉黃酮抑菌效力測定

由表4和圖5可知，用微波輔助法提取的銀杏葉黃酮類化合物具有抗菌活性，但對每種菌的抑制程度有所不同，其中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，這可能是因?yàn)殂y杏葉黃酮對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜造成了損傷，導(dǎo)致大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的活性受到抑制。

表4 銀杏葉黃酮對各菌種的抑菌效力Table 4 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

圖5 銀杏葉黃酮對各菌種的抑菌效力 Fig.5 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對銀杏葉總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，微波法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶20，輻射時間為15 s，微波功率為640 W。在此工藝條件下銀杏葉總黃酮的得率可達(dá)6.82%。銀杏葉黃酮的抑菌試驗(yàn)表明，用微波法提取的銀杏葉黃酮對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。因此可知用該法提取的黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)沒有遭到破壞，具有抑菌活性。

本試驗(yàn)采用微波法提取銀杏葉總黃酮，不僅可以克服傳統(tǒng)提取方法耗時、費(fèi)用高和得率低等缺點(diǎn)，而且操作簡單，溶劑損耗少，副產(chǎn)物少，提取過程中銀杏葉細(xì)粉不凝集、不糊化，有利于銀杏葉黃酮類化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。