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        銀杏葉黃酮的微波輔助提取及其抑菌作用研究

        2020-08-14 07:44:44李敬尤穎呂惠麗穆娟
        中國(guó)調(diào)味品 2020年8期
        關(guān)鍵詞:銀杏葉黃酮類黃酮

        李敬,尤穎,呂惠麗,穆娟

        (河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,石家莊 050061)

        銀杏(GinkgobilobaL.)被稱為植物界的“活化石”,是現(xiàn)今地球上最古老的樹(shù)種之一[1]。銀杏的葉和種仁中含有天然活性物質(zhì)黃酮及苦內(nèi)酯等多種成分,具有溶解膽固醇、擴(kuò)張血管的作用,對(duì)改善腦功能障礙、動(dòng)脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、記憶力減退等有明顯效果[2,3],其防病、治病的價(jià)值在我國(guó)古代就有記載,如《本草綱目》中詳解為:“銀杏,熟食溫肺、益氣、定喘嗽、縮小便、止白濁;生食降痰、消毒殺蟲(chóng)”[4]。近年來(lái),對(duì)銀杏化學(xué)成分、藥理成分及生產(chǎn)應(yīng)用的研究十分流行[5-7]。

        黃酮類化合物是一類低分子天然植物成分,常作為抗菌劑、抗氧化劑及感光劑等[8]。銀杏葉中的黃酮類物質(zhì)不僅是一種比較理想的藥物,也是一類重要的保健食品功能因子,具有廣闊的應(yīng)用前景,是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。但目前黃酮的提取率普遍不高,提高銀杏葉黃酮化合物的提取率已成為進(jìn)行黃酮產(chǎn)品開(kāi)發(fā)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。同時(shí),開(kāi)發(fā)利用黃酮類化合物的抑菌功效,可以為醫(yī)藥食品工業(yè)提供豐富的原料。因此,本文對(duì)銀杏葉黃酮的微波輔助提取工藝及其抑菌作用進(jìn)行了研究,對(duì)銀杏葉黃酮資源的開(kāi)發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 原料與試劑

        銀杏葉:采自河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)校園;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥業(yè)生物制品檢定所;無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無(wú)水乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖:均為分析純;瓊脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨:均為生化試劑。

        1.2 試驗(yàn)儀器

        微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;SHD-III型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫培養(yǎng)箱 上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 銀杏葉黃酮提取工藝流程

        原料(銀杏葉)→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱量→浸提→微波處理→抽濾→脫色→濃縮→黃酮類化合物粗提物。

        1.3.2 銀杏葉總黃酮得率的計(jì)算

        式中:c為黃酮類化合物的濃度,mg/mL;V為提取液的體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為銀杏葉干粉的質(zhì)量,g[9]。

        1.3.3 銀杏葉黃酮抑菌效力的測(cè)定

        采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈[10]。

        1.3.3.1 濾紙片的制備及處理

        將濾紙剪成直徑為8 mm大小的圓片,置于試管中,塞上棉塞,高壓蒸汽滅菌后,放到銀杏葉提取液中浸泡,取出,瀝去多余藥液,直接貼入剛接種供試菌株的培養(yǎng)基上,以浸泡過(guò)無(wú)菌生理鹽水的濾紙片作對(duì)照。

        1.3.3.2 接種培養(yǎng)

        準(zhǔn)確吸取已經(jīng)配制好的菌懸液(大腸桿菌及金黃色葡萄球菌)0.1 mL加入已倒好的平板培養(yǎng)基中,涂布均勻,貼入處理好的濾紙片,每種菌2組培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中,大腸桿菌于37 ℃培養(yǎng)1~2 d,金黃色葡萄球菌于28 ℃培養(yǎng)2~3 d,待菌長(zhǎng)出后觀察是否有抑菌圈。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 乙醇濃度對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

        準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末,每份1.000 g,置于錐形瓶中,按照1∶20 (g/mL)的料液比分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,在480 W微波功率下處理15 s,計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率,以黃酮得率為考察指標(biāo)。

        由圖1可知,在固定料液比1∶20、輻射時(shí)間15 s、微波功率480 W條件下,隨著乙醇濃度的增加,黃酮得率增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí),黃酮類化合物的溶解度最大,得率也最高;而后,當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí),黃酮類化合物的溶解度降低,不利于提取,黃酮得率下降。可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大,溶劑的極性隨之降低,使得提取環(huán)境不利于有極性的黃酮類化合物的溶出,從而造成提取率下降。

        圖1 乙醇濃度對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

        2.2 料液比對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

        準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末,每份1.000 g,置于錐形瓶中,分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入濃度為80%的乙醇,在480 W微波功率下提取15 s,計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率。

        由圖2可知,在固定乙醇濃度80%、輻射時(shí)間15 s、微波功率480 W條件下,黃酮得率隨料液比從1∶10到1∶25逐漸增大,而從1∶25到1∶30逐漸下降??赡苁窃谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量的增加有助于銀杏葉黃酮類化合物的浸出。溶劑用量太少,提取不太完全;但溶劑用量太大,微波加熱的負(fù)荷增大,達(dá)到提取完全所需要的時(shí)間也相應(yīng)增加,結(jié)果在限定時(shí)間(15 s)內(nèi)銀杏葉總黃酮得率反而下降。

        圖2 料液比對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

        2.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

        按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇,用480 W微波功率分別提取6,9,12,15,18 s。計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率,記錄試驗(yàn)結(jié)果。

        由圖3可知,在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、微波功率480 W條件下,銀杏葉總黃酮得率與輻射時(shí)間并不呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的正比關(guān)系,15 s內(nèi)黃酮得率隨輻射時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),15 s以后開(kāi)始下降,15 s時(shí)的得率最高,提取效果最好。原因可能是時(shí)間過(guò)短,黃酮提取不完全;時(shí)間過(guò)長(zhǎng),微波的強(qiáng)熱效應(yīng)又開(kāi)始對(duì)黃酮產(chǎn)生分解作用,導(dǎo)致黃酮得率下降。

        圖3 輻射時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

        2.4 微波功率對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

        按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇,在此條件下,分別用160,320,480,640,800 W微波功率處理15 s,計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率。

        由圖4可知,在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、輻射時(shí)間15 s條件下,隨著微波功率的升高,黃酮類化合物的得率增加;當(dāng)微波處理功率達(dá)到640 W時(shí),總黃酮得率達(dá)到最大值;此時(shí),如果繼續(xù)增大微波功率,總黃酮得率反而下降。原因可能是當(dāng)功率足夠高時(shí),細(xì)胞內(nèi)溫度迅速升高,高溫使細(xì)胞內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞空間膨脹的能力,導(dǎo)致細(xì)胞破裂,同時(shí)也使得細(xì)胞內(nèi)黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,活性降低,從而造成總黃酮得率降低。

        圖4 微波功率對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

        2.5 銀杏葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

        影響微波法提取銀杏葉黃酮類化合物的因素主要是乙醇濃度、料液比、輻射時(shí)間、微波功率等,采用正交試驗(yàn)法確定微波提取銀杏葉黃酮類化合物的最佳條件。

        表1 正交試驗(yàn)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

        由表2可知,這4個(gè)因素的影響大小次序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>B(料液比)>C(輻射時(shí)間)>D(微波功率)。綜合考慮,得出的最佳提取工藝為A2B2C1D1,即乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W。

        表2 微波法提取銀杏葉黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method

        續(xù) 表

        2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

        通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果,基本上確定了微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件,下面準(zhǔn)確稱量3份銀杏葉粉末,每份1.000 g,在最佳工藝條件(乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W)下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率,以黃酮得率為考察指標(biāo),以確定其可行性。

        由表3可知,微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件重復(fù)性好,且黃酮得率高于正交表中的最大黃酮得率,因此確定微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳提取條件為:乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W。在此條件下銀杏葉總黃酮得率為6.82%。

        表3 最佳條件下微波法提取銀杏葉黃酮的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method under the optimal conditions

        2.7 銀杏葉黃酮抑菌效力測(cè)定

        由表4和圖5可知,用微波輔助法提取的銀杏葉黃酮類化合物具有抗菌活性,但對(duì)每種菌的抑制程度有所不同,其中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較好的抑制效果,這可能是因?yàn)殂y杏葉黃酮對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜造成了損傷,導(dǎo)致大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的活性受到抑制。

        表4 銀杏葉黃酮對(duì)各菌種的抑菌效力Table 4 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

        圖5 銀杏葉黃酮對(duì)各菌種的抑菌效力 Fig.5 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用正交試驗(yàn)對(duì)銀杏葉總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,微波法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度為80%,料液比為1∶20,輻射時(shí)間為15 s,微波功率為640 W。在此工藝條件下銀杏葉總黃酮的得率可達(dá)6.82%。銀杏葉黃酮的抑菌試驗(yàn)表明,用微波法提取的銀杏葉黃酮對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。因此可知用該法提取的黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有遭到破壞,具有抑菌活性。

        本試驗(yàn)采用微波法提取銀杏葉總黃酮,不僅可以克服傳統(tǒng)提取方法耗時(shí)、費(fèi)用高和得率低等缺點(diǎn),而且操作簡(jiǎn)單,溶劑損耗少,副產(chǎn)物少,提取過(guò)程中銀杏葉細(xì)粉不凝集、不糊化,有利于銀杏葉黃酮類化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

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