李敬，尤穎，呂惠麗，穆娟

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061)

銀杏(GinkgobilobaL.)被稱為植物界的“活化石”，是現(xiàn)今地球上最古老的樹(shù)種之一[1]。銀杏的葉和種仁中含有天然活性物質(zhì)黃酮及苦內(nèi)酯等多種成分，具有溶解膽固醇、擴(kuò)張血管的作用，對(duì)改善腦功能障礙、動(dòng)脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、記憶力減退等有明顯效果[2,3]，其防病、治病的價(jià)值在我國(guó)古代就有記載，如《本草綱目》中詳解為：“銀杏，熟食溫肺、益氣、定喘嗽、縮小便、止白濁；生食降痰、消毒殺蟲(chóng)”[4]。近年來(lái)，對(duì)銀杏化學(xué)成分、藥理成分及生產(chǎn)應(yīng)用的研究十分流行[5-7]。

黃酮類化合物是一類低分子天然植物成分，常作為抗菌劑、抗氧化劑及感光劑等[8]。銀杏葉中的黃酮類物質(zhì)不僅是一種比較理想的藥物，也是一類重要的保健食品功能因子，具有廣闊的應(yīng)用前景，是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。但目前黃酮的提取率普遍不高，提高銀杏葉黃酮化合物的提取率已成為進(jìn)行黃酮產(chǎn)品開(kāi)發(fā)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。同時(shí)，開(kāi)發(fā)利用黃酮類化合物的抑菌功效，可以為醫(yī)藥食品工業(yè)提供豐富的原料。因此，本文對(duì)銀杏葉黃酮的微波輔助提取工藝及其抑菌作用進(jìn)行了研究，對(duì)銀杏葉黃酮資源的開(kāi)發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

銀杏葉：采自河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)校園；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥業(yè)生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無(wú)水乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖：均為分析純；瓊脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨：均為生化試劑。

1.2 試驗(yàn)儀器

微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；SHD-III型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銀杏葉黃酮提取工藝流程

原料(銀杏葉)→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱量→浸提→微波處理→抽濾→脫色→濃縮→黃酮類化合物粗提物。

1.3.2 銀杏葉總黃酮得率的計(jì)算

式中：c為黃酮類化合物的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為銀杏葉干粉的質(zhì)量，g[9]。

1.3.3 銀杏葉黃酮抑菌效力的測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈[10]。

1.3.3.1 濾紙片的制備及處理

將濾紙剪成直徑為8 mm大小的圓片，置于試管中，塞上棉塞，高壓蒸汽滅菌后，放到銀杏葉提取液中浸泡，取出，瀝去多余藥液，直接貼入剛接種供試菌株的培養(yǎng)基上，以浸泡過(guò)無(wú)菌生理鹽水的濾紙片作對(duì)照。

1.3.3.2 接種培養(yǎng)

準(zhǔn)確吸取已經(jīng)配制好的菌懸液(大腸桿菌及金黃色葡萄球菌)0.1 mL加入已倒好的平板培養(yǎng)基中，涂布均勻，貼入處理好的濾紙片，每種菌2組培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，大腸桿菌于37 ℃培養(yǎng)1～2 d，金黃色葡萄球菌于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待菌長(zhǎng)出后觀察是否有抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末，每份1.000 g，置于錐形瓶中，按照1∶20 (g/mL)的料液比分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在480 W微波功率下處理15 s，計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率，以黃酮得率為考察指標(biāo)。

由圖1可知，在固定料液比1∶20、輻射時(shí)間15 s、微波功率480 W條件下，隨著乙醇濃度的增加，黃酮得率增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，黃酮類化合物的溶解度最大，得率也最高；而后，當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí)，黃酮類化合物的溶解度降低，不利于提取，黃酮得率下降。可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，溶劑的極性隨之降低，使得提取環(huán)境不利于有極性的黃酮類化合物的溶出，從而造成提取率下降。

圖1 乙醇濃度對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.2 料液比對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取5份銀杏葉粉末，每份1.000 g，置于錐形瓶中，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入濃度為80%的乙醇，在480 W微波功率下提取15 s，計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率。

由圖2可知，在固定乙醇濃度80%、輻射時(shí)間15 s、微波功率480 W條件下，黃酮得率隨料液比從1∶10到1∶25逐漸增大，而從1∶25到1∶30逐漸下降?？赡苁窃谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量的增加有助于銀杏葉黃酮類化合物的浸出。溶劑用量太少，提取不太完全；但溶劑用量太大，微波加熱的負(fù)荷增大，達(dá)到提取完全所需要的時(shí)間也相應(yīng)增加，結(jié)果在限定時(shí)間(15 s)內(nèi)銀杏葉總黃酮得率反而下降。

圖2 料液比對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of solid to liquid on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇，用480 W微波功率分別提取6，9，12，15，18 s。計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

由圖3可知，在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、微波功率480 W條件下，銀杏葉總黃酮得率與輻射時(shí)間并不呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的正比關(guān)系，15 s內(nèi)黃酮得率隨輻射時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，15 s以后開(kāi)始下降，15 s時(shí)的得率最高，提取效果最好。原因可能是時(shí)間過(guò)短，黃酮提取不完全；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微波的強(qiáng)熱效應(yīng)又開(kāi)始對(duì)黃酮產(chǎn)生分解作用，導(dǎo)致黃酮得率下降。

圖3 輻射時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.4 微波功率對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響

按照料液比1∶20 (g/mL)加入濃度為80%的乙醇，在此條件下，分別用160，320，480，640，800 W微波功率處理15 s，計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率。

由圖4可知，在固定料液比1∶20、乙醇濃度80%、輻射時(shí)間15 s條件下，隨著微波功率的升高，黃酮類化合物的得率增加；當(dāng)微波處理功率達(dá)到640 W時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值；此時(shí)，如果繼續(xù)增大微波功率，總黃酮得率反而下降。原因可能是當(dāng)功率足夠高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)溫度迅速升高，高溫使細(xì)胞內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞空間膨脹的能力，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，同時(shí)也使得細(xì)胞內(nèi)黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，活性降低，從而造成總黃酮得率降低。

圖4 微波功率對(duì)銀杏葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

2.5 銀杏葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

影響微波法提取銀杏葉黃酮類化合物的因素主要是乙醇濃度、料液比、輻射時(shí)間、微波功率等，采用正交試驗(yàn)法確定微波提取銀杏葉黃酮類化合物的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2可知，這4個(gè)因素的影響大小次序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>B(料液比)>C(輻射時(shí)間)>D(微波功率)。綜合考慮，得出的最佳提取工藝為A2B2C1D1，即乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W。

表2 微波法提取銀杏葉黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method

續(xù) 表

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果，基本上確定了微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件，下面準(zhǔn)確稱量3份銀杏葉粉末，每份1.000 g，在最佳工藝條件(乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W)下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算銀杏葉總黃酮的得率，以黃酮得率為考察指標(biāo)，以確定其可行性。

由表3可知，微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件重復(fù)性好，且黃酮得率高于正交表中的最大黃酮得率，因此確定微波法提取銀杏葉中黃酮類化合物的最佳提取條件為：乙醇濃度為80%、料液比為1∶20、輻射時(shí)間為15 s、微波功率640 W。在此條件下銀杏葉總黃酮得率為6.82%。

表3 最佳條件下微波法提取銀杏葉黃酮的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification experimental results of flavonoids extracted from Ginkgo biloba leaves by microwave method under the optimal conditions

2.7 銀杏葉黃酮抑菌效力測(cè)定

由表4和圖5可知，用微波輔助法提取的銀杏葉黃酮類化合物具有抗菌活性，但對(duì)每種菌的抑制程度有所不同，其中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，這可能是因?yàn)殂y杏葉黃酮對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜造成了損傷，導(dǎo)致大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的活性受到抑制。

表4 銀杏葉黃酮對(duì)各菌種的抑菌效力Table 4 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

圖5 銀杏葉黃酮對(duì)各菌種的抑菌效力 Fig.5 Inhibitory effect of flavonoids from Ginkgo biloba leaves on various strains

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)對(duì)銀杏葉總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，微波法提取銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶20，輻射時(shí)間為15 s，微波功率為640 W。在此工藝條件下銀杏葉總黃酮的得率可達(dá)6.82%。銀杏葉黃酮的抑菌試驗(yàn)表明，用微波法提取的銀杏葉黃酮對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。因此可知用該法提取的黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有遭到破壞，具有抑菌活性。

本試驗(yàn)采用微波法提取銀杏葉總黃酮，不僅可以克服傳統(tǒng)提取方法耗時(shí)、費(fèi)用高和得率低等缺點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單，溶劑損耗少，副產(chǎn)物少，提取過(guò)程中銀杏葉細(xì)粉不凝集、不糊化，有利于銀杏葉黃酮類化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。