晉文慧，陳暉，洪專

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361005)

縊蟶(SinonovaculaconstrictaLamarck)隸屬軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、竹蟶科，又名蟶子，廣泛分布于中國(guó)、日本和朝鮮等國(guó)的沿海地區(qū)?？O蟶是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，其肉質(zhì)豐腴脆嫩，鮮美清甜，還具有補(bǔ)虛、止痢之功效，深受人們的喜愛[1]。福建是全國(guó)的養(yǎng)蟶大省，養(yǎng)殖產(chǎn)量常年位居全國(guó)前列。2018年福建省蟶類養(yǎng)殖總面積達(dá)到13407公頃，產(chǎn)量達(dá)到279485噸，約占全國(guó)的1/3?？O蟶中含有豐富的氨基酸、短肽、核苷酸、有機(jī)酸等多種呈味物質(zhì)，是作為天然水產(chǎn)調(diào)味品的良好原料[2]。特別是其中的游離氨基酸，對(duì)水產(chǎn)食品新鮮度的評(píng)價(jià)和風(fēng)味的貢獻(xiàn)有非常重要的作用。如丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸都會(huì)影響其風(fēng)味和口感，丙氨酸和谷氨酸具有甜味等，而精氨酸等其他游離氨基酸對(duì)貝類鮮味風(fēng)味也起到重要作用[3,4]。目前，關(guān)于縊蟶的研究主要集中在養(yǎng)殖和粗加工方面，而深加工特別是綜合開發(fā)方面的研究卻很少，大量的縊蟶資源沒有得到很好的開發(fā)和利用。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們對(duì)于生活質(zhì)量的要求也越來越高，調(diào)味品也越來越多樣化。通過酶解或者美拉德反應(yīng)等開發(fā)新型水產(chǎn)調(diào)味品[5-9]，不僅能夠滿足現(xiàn)代人對(duì)生活品質(zhì)的要求，而且能夠?qū)λa(chǎn)品資源進(jìn)行深度加工，提高低值原料的附加值，將會(huì)產(chǎn)生顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[10-13]。本研究以縊蟶肉為原料，通過選用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆猓岣呙附庖褐谐饰段镔|(zhì)的含量。通過單因素、正交實(shí)驗(yàn)、雙酶復(fù)合等方式優(yōu)化酶解工藝條件，采用離子色譜法測(cè)定縊蟶酶解液中游離氨基酸的含量，確定了最佳工藝參數(shù)。本研究成果為縊蟶天然調(diào)味品的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，將能促進(jìn)水產(chǎn)加工及調(diào)味品行業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 原料

縊蟶：購于廈門市翔安區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶等：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；諾維信蛋白酶 Protamex：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；醋酸鈉、氫氧化鈉：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：色譜純，美國(guó)Sigma公司；其他所用試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

ICS-5000離子色譜儀 美國(guó)Thermo公司；ET18自動(dòng)電位滴定儀 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

縊蟶開殼取肉后清洗干凈，瀝干水分，放入組織搗碎機(jī)中打成泥漿備用。稱取一定量搗碎后的肉泥，按照料水比1∶1加入水，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同量的酶，分散后調(diào)節(jié)pH，放入水浴鍋中，于相應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解。經(jīng)一定時(shí)間后，滅酶(80 ℃，30 min)，冷卻，轉(zhuǎn)移到離心管中離心(20000 r/min，20 min)，取上清液。

1.3.2 酶解

用酶對(duì)食品行業(yè)中常用的胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、諾維信蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶等進(jìn)行篩選，根據(jù)文獻(xiàn)[14,15]設(shè)計(jì)各酶的最適水解條件，以呈味核苷酸二鈉、氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，對(duì)7種酶的酶解效果進(jìn)行篩選。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

篩選出合適的酶后，以氨基酸態(tài)氮、呈味核苷酸二鈉為指標(biāo)，對(duì)影響酶解的時(shí)間、溫度、酶用量、pH等因素進(jìn)行比較研究。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶添加量、pH、酶解溫度等參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3.5 復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)

在最佳用酶篩選實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶進(jìn)行復(fù)合，分別按中性蛋白酶∶諾維信蛋白酶為1∶1、2∶1、1∶2的比例進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3.6 氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：參照GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[16]；呈味核苷酸二鈉含量的測(cè)定：參照GB 1886.171-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑5′-呈味核苷酸二鈉(又名呈味核苷酸二鈉)》[17]。

1.3.7 游離氨基酸含量的測(cè)定

吸取酶解液100 μL置于5 mL離心管中，加入300 μL無水乙醇混勻后，10000 r/min離心5 min，取上層清液用氮吹儀吹干，加水1 mL復(fù)溶，過濾后采用離子色譜儀進(jìn)行分析。

測(cè)試條件：色譜柱：Thermo AminoPac PA-10(2 mm×250 mm，10 μm)；流速：0.24 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 氨基酸測(cè)定梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for amino acids analysis

根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積，采用外標(biāo)法對(duì)縊蟶酶解液中游離氨基酸組成及含量進(jìn)行分析，單位以μmol/L表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶的最佳用酶篩選

各酶的酶解條件見表2，酶解后氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉的含量測(cè)定結(jié)果見圖1。

表2 不同酶的酶解條件Table 2 Hydrolysis conditions of different enzymes

圖1 酶種類的篩選Fig.1 The screening of enzyme species

由圖1可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶和諾維信蛋白酶酶解縊蟶后，酶解液中氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉的含量都較高，但是由于在酶解過程中堿性蛋白酶和胰酶的氣味較刺鼻，故選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶為縊蟶酶解最佳用酶。以中性蛋白酶為例，對(duì)影響酶解的時(shí)間、溫度、酶用量、pH等因素進(jìn)行了比較研究。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

中性蛋白酶在酶解溫度50 ℃、酶用量0.2%、pH 7的條件下，分別設(shè)置酶解時(shí)間為0，0.5，1，2，4，6，8 h，考察酶解液中氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的變化情況，結(jié)果見圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)酶解的影響Fig.2 Effect of time on the hydrolysis

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解液中氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量也隨之增加。酶解液中氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的增加速度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h后，這兩種呈味物質(zhì)的含量趨于平緩。這是因?yàn)榈鞍追肿由系拿缸饔梦稽c(diǎn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，同時(shí)酶解產(chǎn)物的累積抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行。因此，選擇適宜的酶解時(shí)間為6 h。

2.2.2 溫度對(duì)酶解效果的影響

中性蛋白酶在酶用量0.2%、pH 7、酶解時(shí)間6 h的條件下，分別考察酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃對(duì)酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)酶解的影響Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時(shí)，酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量隨著溫度升高顯著增大，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量達(dá)到最大，此時(shí)再升高溫度，酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量降低?？梢姡诿附膺^程中，隨著酶解溫度的升高，酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高。酶解溫度過低或過高時(shí)，蛋白酶的活性受到抑制，適當(dāng)提高溫度可增加酶的活力；但當(dāng)溫度過高時(shí)，酶受熱使其構(gòu)像被破壞，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率也隨之降低。當(dāng)酶解溫度趨近酶解最適溫度時(shí)，酶解效率最高，因此中性蛋白酶的最適酶解溫度為50 ℃。

2.2.3 酶用量對(duì)酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、pH 7、酶解時(shí)間6 h的條件下，分別考察酶用量為0.1%、0.2%、0.5%、1%對(duì)酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶用量對(duì)酶解的影響Fig.4 Effect of enzyme additive amount on the hydrolysis

由圖4可知，當(dāng)酶用量增加時(shí)，底物水解反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，蛋白質(zhì)水解程度加大，酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量升高，酶用量超過0.2%時(shí)，增加速度較小。當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值時(shí)，再增加酶濃度難以促進(jìn)水解反應(yīng)。因此，適宜的酶用量為0.2%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用中的生產(chǎn)成本問題，將后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)中的酶添加量控制在0.2%以下。

2.2.4 pH對(duì)酶解效果的影響

在不同pH下，蛋白質(zhì)的解離程度不同，所以酶解的效果也不盡相同。中性蛋白酶在酶添加量0.2%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間6 h的條件下，分別考察初始pH為5，6，7，8，9對(duì)酶解液氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對(duì)酶解的影響Fig.5 Effect of pH values on the hydrolysis

由圖5可知，pH過高或過低，均不利于氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉等呈味物質(zhì)的釋放，中性蛋白酶對(duì)縊蟶的最適酶解pH為7。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、酶添加量、酶解pH為考察因素，以縊蟶酶解中氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，分別對(duì)中性蛋白酶和諾維信蛋白酶設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3和表4。

表3 中性蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 The orthogonal experiment design and results of neutral protease

表4 諾維信蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 4 The orthogonal experiment design and results of novozyme protease

由方差分析中極差R值大小可知，中性蛋白酶和諾維信蛋白酶各因素對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響順序大小都為：酶添加量>初始pH>酶解溫度，結(jié)果是一致的。對(duì)各因素進(jìn)行直觀分析，中性蛋白酶添加量：K1>K2>K3；諾維信蛋白酶添加量：K1>K3>K2；中性蛋白酶和諾維信蛋白酶溫度均為：K2>K3>K1；中性蛋白酶pH：K2>K1>K3，諾維信蛋白酶pH：K1>K3>K2。綜上所述，中性蛋白酶酶解縊蟶最佳配比組合確定為A1B2C2，即溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，pH為7時(shí)酶解效果最佳。諾維信蛋白酶酶解縊蟶最佳配比組合確定為A1B2C1，即溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，pH為6.5時(shí)酶解效果最佳。在此最佳配比組合下，酶解液澄清透明,色澤金黃，甜咸適度，無腥味，具有良好的縊蟶特征風(fēng)味。

2.4 復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將中性蛋白酶和諾維信蛋白酶按2∶1、1∶1、1∶2的比例進(jìn)行復(fù)合，在最優(yōu)條件下(pH 6.5)對(duì)縊蟶進(jìn)行酶解，與單酶在最優(yōu)條件下的酶解效果進(jìn)行對(duì)比，篩選最優(yōu)的酶復(fù)合比例，結(jié)果見圖6。

圖6 不同比例復(fù)合酶的酶解效果Fig.6 Hydrolysis effect of compound enzymes with different proportions

由圖6可知，在不同的復(fù)合比例下，復(fù)合酶酶解液中氨基酸態(tài)氮及呈味核苷酸二鈉的含量均比單酶酶解后要高，其中又以中性蛋白酶和諾維信蛋白酶按1∶1進(jìn)行復(fù)合時(shí)酶解效率最高。對(duì)酶解前后溶液中的游離氨基酸組成及含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5 酶解前后溶液中游離氨基酸的組成及其含量Table 5 Composition and content of free amino acids in solution before and after enzymatic hydrolysis μmol/L

由表5可知，用離子色譜法分析縊蟶酶解液中的氨基酸，共檢測(cè)出17種氨基酸,其中含有8種必需氨基酸，必需氨基酸約占氨基酸總量的61%。中性蛋白酶酶解后得到的游離氨基酸總量為1205.34 μmol/L，諾維信蛋白酶酶解后得到的游離氨基酸總量為946.5 μmol/L，而酶解前游離氨基酸總量為826.38 μmol/L，游離氨基酸含量比酶解前明顯增多，部分氨基酸達(dá)到酶解前的2倍之多。酶解后溶液中游離氨基酸和谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸等幾種呈味氨基酸的總量均有明顯增加，甘氨酸含量相對(duì)較高, 使水解液呈現(xiàn)較強(qiáng)的鮮味。其中中性蛋白酶酶解后游離氨基酸和呈味氨基酸的增加量較諾維信蛋白酶多，呈味氨基酸所占的比例也更高，從酶解前的34.46%升高到38.01%。雖然二者的氨基酸態(tài)氮含量接近，但中性蛋白酶水解產(chǎn)物具有更好的風(fēng)味。在復(fù)合酶的水解中，精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和組氨酸的含量均顯著高于單酶酶解時(shí)的含量，而精氨酸和甘氨酸是除谷氨酸外對(duì)海鮮味產(chǎn)生重要作用的氨基酸，甘氨酸和絲氨酸有柔和的甜味，可以顯著增加酶解液的風(fēng)味[18,19]。總之，復(fù)合酶解產(chǎn)生的游離氨基酸、呈味氨基酸以及呈味氨基酸的比例均比單酶進(jìn)一步升高，而復(fù)合酶又以二者比例為1∶1時(shí)達(dá)到最高值1284.63 μmol/L，呈味氨基酸的比例增至38.74%，酶解后的縊蟶中各類氨基酸的含量出現(xiàn)了較大的增長(zhǎng)，氨基酸總量相比酶解前增加了1.55倍，其中呈味氨基酸增加了1.75倍。結(jié)果表明，這一比例的復(fù)合酶酶解縊蟶能夠產(chǎn)生最佳的風(fēng)味。

3 結(jié)論

本文選擇了食品行業(yè)中常用的幾種酶對(duì)縊蟶進(jìn)行酶解，綜合考慮了氨基酸態(tài)氮和呈味核苷酸二鈉的含量以及酶解液的氣味，選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶為最佳用酶。對(duì)中性蛋白酶酶解時(shí)間、酶解溫度、酶用量、pH等酶解條件進(jìn)行了研究，初步確定了最適酶解條件。采用三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了中性蛋白酶的最佳酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，酶解pH為7，諾維信蛋白酶的最佳酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，酶解pH為6.5。對(duì)兩種酶復(fù)合后酶解縊蟶的效果也進(jìn)行了比較，并采用離子色譜法檢測(cè)了游離氨基酸的含量，結(jié)果顯示：在設(shè)定的復(fù)合比例下，復(fù)合酶酶解效果均優(yōu)于單酶，游離氨基總量、呈味氨基酸總量以及呈味氨基酸的比例均有所增加，其中又以1∶1復(fù)合效果最好，表明此兩種酶在酶解縊蟶時(shí)具有很好的協(xié)調(diào)增效作用，能夠酶解縊蟶產(chǎn)生最佳的風(fēng)味。本研究成果為縊蟶天然調(diào)味品的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。