胡洋，崔春

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，其含有豐富的氨基酸、糖類、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等成分，能夠賦予菜肴鮮艷的色澤和鮮香的滋味，深受人們的喜愛[1,2]。醬油在加熱滅菌過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量的沉淀，其主要成分是蛋白質(zhì)。導(dǎo)致沉淀產(chǎn)生的原因可能有[3]：原料蛋白的不適度變性；發(fā)酵過(guò)程蛋白水解不完全；雜菌的污染；水解過(guò)程中生成不溶性的產(chǎn)物；醬油中蛋白膠體穩(wěn)定性被破壞導(dǎo)致聚集等。醬油沉淀的產(chǎn)生不僅降低了原料的蛋白質(zhì)利用率，而且難以與澄清的醬油有效分離。

良好的起泡性也是人們選購(gòu)醬油的一項(xiàng)指標(biāo)，搖晃醬油瓶時(shí)形成大小均勻且不易消散的泡沫被許多人認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)醬油的表現(xiàn)。醬油沉淀中含有豐富的蛋白質(zhì)，采用蛋白酶法對(duì)醬油沉淀進(jìn)行適度水解改性不僅能夠制備具有良好起泡性和泡沫穩(wěn)定性的起泡蛋白，還可以提高醬油沉淀蛋白的回收利用率，實(shí)現(xiàn)對(duì)醬油沉淀的高值化利用；而且將醬油沉淀酶解物應(yīng)用于醬油中，可顯著提高醬油品質(zhì)。鑒于此，本試驗(yàn)研究了pH值、蛋白濃度、水解度對(duì)醬油沉淀蛋白控制酶解制備起泡蛋白的影響，并研究了黃原膠的添加對(duì)泡沫性質(zhì)的改善效果，并從粘度、表面疏水性、ζ-電位等的變化的角度分析了不同因素及黃原膠添加對(duì)沉淀蛋白泡沫性質(zhì)影響的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

醬油沉淀：廣東某醬油廠提供的加熱滅菌后產(chǎn)生的醬油渾濁液；37071蛋白酶：諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；甲醛、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、黃原膠：分析純，廣州市叢源儀器有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備

GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；ME204E萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；FJ200-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)準(zhǔn)模型廠；XW-80A微型漩渦混合儀 滬西分析儀器廠；Synergy NEO2 HTS全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；NDJ-8S型數(shù)顯粘度計(jì) 上海精天電子儀器有限公司。

1.2 醬油沉淀蛋白的酶解

1.2.1 醬油沉淀的分離和收集

醬油渾濁液以60 ℃蒸餾水清洗2次，離心去除上清即得到不溶性的醬油沉淀，將沉淀真空冷凍干燥后備用。用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量為(32.589±0.142) g/100 g。

1.2.2 酶解工藝

將醬油沉淀以1∶4的料液比加水，在pH 10、37071蛋白酶添加量0.2%、溫度45 ℃下水解1，3，6，9，12 h，酶解結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至5.0，100 ℃滅酶15 min，離心去除殘?jiān)蠹吹玫结u油沉淀蛋白酶解液。

1.3 醬油沉淀蛋白及不同水解度沉淀蛋白水解物的泡沫性質(zhì)

1.3.1 pH值、蛋白濃度對(duì)醬油沉淀蛋白泡沫性質(zhì)的影響

將醬油沉淀用蒸餾水配制成蛋白濃度為2%和4%的分散液，調(diào)pH至5，7，9，11，測(cè)定起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.3.2 pH值、蛋白濃度對(duì)不同水解度沉淀蛋白水解物泡沫性質(zhì)的影響

不同時(shí)間酶解以獲得不同水解度的沉淀蛋白水解物。將不同水解度的蛋白水解物用蒸餾水配制成蛋白濃度為2%和4%的分散液，調(diào)pH至5，7，9，測(cè)定起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.4 不同黃原膠添加量下沉淀蛋白水解物的泡沫性質(zhì)

將酶解3 h和12 h的沉淀蛋白水解物用蒸餾水配制成蛋白濃度為4%的分散液，添加0.000%、0.025%、0.050%、0.075%、0.100%(W/V)的黃原膠，然后分別調(diào)pH至5和7，測(cè)定起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 水解度DH的測(cè)定[4]

采用甲醛滴定法測(cè)定醬油沉淀蛋白酶解液中的氨態(tài)氮含量，采用凱氏定氮法測(cè)定醬油沉淀中的總氮含量，水解度計(jì)算公式如下：

水解度(%)=(酶解液中氨態(tài)氮含量/沉淀總氮含量)×100。

1.5.2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定[5]

取10 mL一定濃度的蛋白分散液，用均質(zhì)機(jī)以10000 r/min攪打1 min，記錄0 min和30 min時(shí)泡沫和溶液的總高度V0和V30，試驗(yàn)重復(fù)3次，起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下：

1.5.3 粘度測(cè)定

使用NDJ-8S數(shù)顯粘度計(jì)測(cè)定樣品的粘度。預(yù)實(shí)驗(yàn)使用不同的轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)速組合確定大致的粘度范圍，使扭矩百分比的數(shù)值在10%～100%內(nèi)。

1.5.4 表面疏水性測(cè)定[6，7]

表面疏水性的測(cè)定采用ANS熒光探針法。用0.01 mol/L pH為5和7的磷酸鹽緩沖液將測(cè)定樣品稀釋至蛋白濃度范圍為0.05～10.8 mg/mL之間的6個(gè)濃度梯度。取稀釋液2 mL，加入20 μL 8 mmol/L的ANS，振蕩混勻后靜置3 min，采用全功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。儀器測(cè)定條件設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫寬度5 nm。分別以蛋白濃度和熒光強(qiáng)度為橫、縱坐標(biāo)軸繪制曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

1.5.5 ζ-電位測(cè)定

用0.01 mol/L pH 5和pH 7的磷酸鹽緩沖液將測(cè)定樣品稀釋至蛋白濃度為5 mg/mL，取1 mL稀釋液于樣品池中，25 ℃下測(cè)定3次，結(jié)果以平均值呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值、蛋白濃度對(duì)醬油沉淀蛋白泡沫性質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著pH值的增加，醬油沉淀蛋白的起泡性不斷提高，但是泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。良好的溶解度是蛋白質(zhì)呈現(xiàn)良好起泡性的重要條件，等電點(diǎn)附近蛋白質(zhì)溶解度較低，沉淀的蛋白較多，沒有足夠的蛋白吸附到界面，因此起泡性較差；當(dāng)pH值逐漸偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶電荷增加，由于靜電排斥，不利于形成緊密的界面膜，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性降低[8]。

圖1 不同pH值、蛋白濃度對(duì)醬油沉淀蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of pH values and protein concentration on the foaming property and foam stability of soy sauce precipitated protein

2.2 不同pH值、蛋白濃度對(duì)不同水解度沉淀蛋白水解物泡沫性質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，沉淀蛋白水解度不斷增大，由初始的14.16%提高到27.05%。隨著水解的進(jìn)行，pH 5和pH 7下沉淀蛋白水解物的起泡性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在水解3 h時(shí)達(dá)到最大值。李鴻健等[9]的研究也呈現(xiàn)相同的規(guī)律，適度的酶解可改善蛋白的起泡性，因?yàn)榈鞍妆凰庑纬啥嚯?，更多的疏水區(qū)域暴露并且分子柔性增加；但是水解程度繼續(xù)提高會(huì)使肽鏈越來(lái)越短，界面處形成的液膜越來(lái)越弱，又導(dǎo)致起泡性和泡沫穩(wěn)定性下降。pH值對(duì)沉淀蛋白水解物起泡性影響的變化趨勢(shì)與原始沉淀蛋白的相反，其在pH 5下最優(yōu)。可能的原因是：對(duì)于沉淀蛋白水解物，蛋白的溶解度已經(jīng)不是限制起泡性的因素，pH 5下水解物的溶解度高且此時(shí)分子間和界面處的排斥作用小，對(duì)起泡性更有利。研究蛋白濃度對(duì)泡沫性質(zhì)的影響，結(jié)果顯示：4%蛋白濃度下的起泡性和泡沫穩(wěn)定性更高，因?yàn)榈鞍诐舛雀撸軌蛭降浇缑嫫鹱饔玫牡鞍椎牧恳哺唷?/p>

圖2 不同pH值、蛋白濃度對(duì)不同水解度沉淀蛋白水解物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of pH values and protein concentration on the foaming property and foam stability of hydrolysates of soy sauce precipitated protein with different hydrolysis degrees

2.3 不同pH值、黃原膠添加量對(duì)沉淀蛋白水解物泡沫性質(zhì)的影響

為了進(jìn)一步改善醬油沉淀蛋白的泡沫性質(zhì)，研究了接近醬油pH值(pH 5)和常規(guī)pH值(pH 7)下添加一定量的黃原膠對(duì)3 h(DH 25.23%)和12 h(DH 27.05%)水解物泡沫性質(zhì)的影響。由圖3可知，在pH 5和pH 7下，添加0.050%～0.100%的黃原膠對(duì)水解物的泡沫穩(wěn)定性均有顯著的改善效果，且pH 5下的改善效果更顯著。在pH 5下，添加0.100%的黃原膠，3 h水解物的泡沫穩(wěn)定性由43.55%提高到94.70%，12 h水解物的泡沫穩(wěn)定性由44.44%提高到88.73%；在pH 7下，添加0.100%的黃原膠，3 h水解物的泡沫穩(wěn)定性由42.96%提高到80.32%，12 h水解物的泡沫穩(wěn)定性由33.75%提高到69.05%。對(duì)于3 h水解物，在pH 5下添加0.025%的黃原膠，泡沫穩(wěn)定性就已經(jīng)提高到了75.24%。當(dāng)多糖添加量超過(guò)0.025%時(shí)，起泡性有一定程度的下降，這可能是因?yàn)榘l(fā)泡液粘度的增大阻礙了空氣的混入。

圖3 不同pH值、黃原膠添加量對(duì)3，12 h沉淀蛋白水解物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of pH values and xanthan gum additive amount on the foaming property and foam stability of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3,12 h

2.4 不同pH下黃原膠添加量對(duì)3，12 h沉淀蛋白水解物分散液粘度的影響

由圖4可知，蛋白水解物分散液的粘度僅與黃原膠的添加量有關(guān)，不同水解度(3 h和12 h水解)和不同pH值(pH 5和pH 7)對(duì)分散液粘度的影響不大。然而黃原膠對(duì)3 h和12 h水解物泡沫穩(wěn)定性的改善效果不同，說(shuō)明除了多糖添加增加的粘度，泡沫穩(wěn)定性還與蛋白和多糖間存在的相互作用有關(guān)。Martinez等[10]也研究了不同添加量多糖對(duì)不同水解度向日葵蛋白泡沫性質(zhì)的影響，他們認(rèn)為添加多糖泡沫穩(wěn)定性的提高與本體粘度和界面蛋白-多糖相互作用導(dǎo)致的薄膜彈性增加有關(guān)。

圖4 不同pH下黃原膠添加量對(duì)3，12 h沉淀蛋白水解物分散液粘度的影響Fig.4 Effects of xanthan gum additive amount on the viscosity of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3, 12 h at different pH values

2.5 不同pH下水解時(shí)間及添加0.05%黃原膠對(duì)沉淀蛋白水解物表面疏水性的影響

不同pH下水解時(shí)間及添加0.50%黃原膠對(duì)沉淀蛋白水解物表面疏水性的影響見圖5。

圖5 不同pH下水解時(shí)間及添加0.05%黃原膠對(duì)沉淀蛋白水解物表面疏水性的影響Fig.5 Effects of enzymolysis time and adding 0.05% xanthan gum on the surface hydrophobicity of hydrolysates of soy sauce precipitated protein at different pH values

許多研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性對(duì)其泡沫性質(zhì)具有重要意義，表面疏水性增加，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)吸附至界面，降低表面張力，改善起泡性。pH 5下整體的表面疏水性高于pH 7下，這可能是pH 5下水解物起泡性和泡沫穩(wěn)定性更佳的一個(gè)原因。醬油沉淀蛋白水解物的表面疏水性隨著水解度的增加而不斷增大。因?yàn)槊父男允沟鞍妆恢鸩剿鉃殡亩?，使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性增加。沉淀蛋白在水解3 h時(shí)獲得了最高的起泡性，這也說(shuō)明了表面疏水性不是影響起泡性的唯一因素，酶解后蛋白的帶電荷和粒徑的變化等情況也影響著起泡性。添加0.05%黃原膠的水解物分散液表面疏水性更低，這可能是多糖的粘附覆蓋了一些疏水基團(tuán)。

2.6 不同pH下添加0.05%黃原膠對(duì)3，12 h沉淀蛋白水解物ζ-電位的影響

ζ-電位能夠衡量顆粒間相互吸引或排斥作用力的強(qiáng)度，它的數(shù)值與分散體系的穩(wěn)定性相關(guān)[11]。分子間需要適當(dāng)?shù)某饬Γ绻饬^(guò)大會(huì)影響顆粒吸附到界面從而影響表面性質(zhì)，但斥力過(guò)小會(huì)引起分子間發(fā)生聚集[12]。由表1可知，ζ-電位數(shù)值均為負(fù)值，顆粒均帶負(fù)電。pH 7下整體的帶電荷量高于pH 5下的，3 h和12 h水解物的帶電荷量差異不大。添加0.05%黃原膠的樣品電位更高，因?yàn)辄S原膠是一種陰離子多糖，與蛋白的結(jié)合使電位變大。ζ-電位對(duì)于泡沫性質(zhì)的影響應(yīng)該結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)看，如果蛋白質(zhì)水解后結(jié)構(gòu)變化有利于界面吸附，那么ζ-電位的降低就有利于泡沫穩(wěn)定性。

表1 不同pH下添加0.05%黃原膠對(duì)3，12 h沉淀蛋白水解物ζ-電位的影響Table 1 Effects of adding 0.05% xanthan gum on Zeta potential of hydrolysates of soy sauce precipitated protein hydrolyzed for 3, 12 h at different pH values

3 結(jié)論

醬油沉淀蛋白的起泡性隨著pH值的升高不斷增加，但泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。在4%蛋白濃度下，pH 5時(shí)沉淀蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別為24.02%和43.75%，pH 11時(shí)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別為43.46%和15.80%。

為了改善醬油沉淀蛋白的泡沫性質(zhì)及實(shí)現(xiàn)醬油沉淀的高值化利用，采用37071蛋白酶進(jìn)行適度水解。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度不斷增加，研究發(fā)現(xiàn)水解3 h時(shí)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最高。pH值對(duì)沉淀蛋白水解物泡沫性質(zhì)的影響與原始沉淀蛋白的相反，其在pH 5下最優(yōu)，3 h蛋白水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別達(dá)到59.00%和43.55%。

添加黃原膠以改善沉淀蛋白水解物的泡沫性質(zhì)，當(dāng)黃原膠添加量為0.05%～0.1%時(shí)，均能顯著提高3 h和12 h沉淀蛋白水解物的泡沫穩(wěn)定性，但是添加量過(guò)大會(huì)因?yàn)轶w系粘度的增加影響起泡性。在pH 5下，添加0.05%的黃原膠，3 h水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別達(dá)到54.00%和81.81%。

本試驗(yàn)還從粘度、表面疏水性、ζ-電位等的變化的角度分析了pH值、水解度、黃原膠添加對(duì)沉淀蛋白水解物泡沫性質(zhì)影響的機(jī)理，這些指標(biāo)對(duì)于研究蛋白的表面性質(zhì)都具有重要的意義，需要綜合起來(lái)進(jìn)行分析。