戴楠，趙曉龍，代曉燕，李夢(mèng)俠

0 引言

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%～85%[2]，大部分NSCLC患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)，已經(jīng)進(jìn)入晚期[3]。含鉑方案是晚期無驅(qū)動(dòng)基因突變NSCLC的主要化療方案[4]，但是由于大部分患者對(duì)鉑類化療不敏感，這些方案的治療效果并不理想。因此探索NSCLC鉑類耐藥的機(jī)制，尋找有效的靶點(diǎn)，降低NSCLC對(duì)順鉑的抵抗能力，在NSCLC的治療中顯得尤為重要。

研究顯示，對(duì)鉑類化療藥物敏感度下降的NSCLC患者，血液中脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（apurinic aprimidinic endonuclease 1,APE1）水平升高[5]，提示外周循環(huán)中的APE1可能在鉑類耐藥中發(fā)揮重要作用。APE1是典型的核定位蛋白，缺乏典型分泌信號(hào)肽[6]，目前其出核機(jī)制尚未完全闡明，因此血液中出現(xiàn)APE1蛋白這一反?，F(xiàn)象引起了我們的思考。外泌體是內(nèi)含核酸、蛋白、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)的細(xì)胞外小囊泡[7]。近年來，有研究顯示APE1可通過外泌體分泌到細(xì)胞外[8]。由此，APE1可能存在于外泌體中，并通過外泌體傳遞到受體細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感度。本研究選取NSCLC細(xì)胞株A549作為研究對(duì)象，觀察細(xì)胞外泌體APE1的表達(dá)變化對(duì)受體細(xì)胞順鉑敏感度的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國BI公司；10%去外泌體胎牛血清購自上海VivaCell公司；細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒購自美國Invitrogen公司（貨號(hào)4478359）；抗APE1（貨號(hào)ab137708）、Alix（貨號(hào)ab117600）、CD9（貨號(hào)ab223052），CD63（貨號(hào)ab59479）、β-tubulin（貨號(hào)ab6046）抗體購自英國Abcam公司，抗Calnexin（AF2425）、γ-H2AX（AF5836）抗體購自中國碧云天公司，PKH26購自美國Sigma-Aldrich公司，APE1敲低和高表達(dá)慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，AT-101、E3330、inhibitor compound#3購自美國Selleckchem公司。MP-4型電泳儀及轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad公司，美國），透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本），納米粒度顆粒跟蹤分析儀（ZetaView S/N 17-310，德國），激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞購自美國ATCC公司（Manassas，VA，美國）。將細(xì)胞（1×105個(gè)/毫升）接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含90%RPMI1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1%的青-鏈霉素），置于37℃、5%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%左右，換含10%去外泌體胎牛血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液用于提取外泌體。

1.2.2 外泌體分離和鑒定 取收集好的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃，500g離心10 min，取上清液重復(fù)一次，2 000g離心30 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾后，用細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒，按說明書步驟提取細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體。收集的外泌體沉淀采用RIPA裂解液重懸用于Western blot分析；無菌PBS重懸用于細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。外泌體樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blot分析 取收集好的外泌體裂解液，12 000g高速離心15 min，加入5×上樣緩沖液，100℃變性5 min。配制SDS-Page膠，蛋白上樣電泳，100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)膜90 min，在5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加入一抗稀釋液（APE1 1:1 000，Alix 1:1 000，CD9 1:1 000，CD63 1:1 000，Calnexin 1:1 000，β-tubulin 1:2 000，γ-H2AX 1:1 000），4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)種屬二抗（1:5 000），37℃孵育1 h，TBST洗滌，采用化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)顯影。采用Gel-Pro Analyzer軟件分析各組條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值，用于評(píng)估目的蛋白表達(dá)量。

1.2.4 透射電子顯微鏡和納米示蹤分析（NTA）取外泌體樣本5 μl滴加在載樣銅網(wǎng)上，室溫孵育5 min，孵育結(jié)束后，用吸水紙?jiān)谝粋?cè)吸干多余液體；向銅網(wǎng)上滴加一滴2%的乙酸雙氧鈾，室溫孵育3 min；孵育結(jié)束后，用吸水紙?jiān)谝粋?cè)吸干液體，室溫放置2 h晾干，透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。取凍存樣本，25℃水浴解凍，冰上放置。取10 μl樣本進(jìn)行相應(yīng)比例稀釋，利用納米粒度顆粒跟蹤分析儀進(jìn)行納米示蹤分析。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 按1×105個(gè)/孔接種A549細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，根據(jù)公式病毒體積=（MOI×細(xì)胞數(shù)目）/病毒滴度進(jìn)行病毒感染，感染12 h補(bǔ)液培養(yǎng)至24 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h熒光表達(dá)豐度較高，用熒光顯微鏡觀察感染效率80%左右且細(xì)胞生長狀態(tài)良好，加入含一定濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行篩選48 h，熒光顯微鏡下觀察鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)收集細(xì)胞凍存?zhèn)溆?。?xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒空白或無義序列載體作為對(duì)照組（NC）。

1.2.6 APE1抑制劑處理細(xì)胞 細(xì)胞分別加入3種APE1功能抑制劑（inhibitor compound #3：APE1內(nèi)切酶活性的催化抑制劑；E3330：臨床試驗(yàn)廣泛應(yīng)用的APE1氧化還原活性抑制劑；AT101：醋酸棉酚的R-(-)型對(duì)映體，直接與APE1相互作用的APE1活性抑制劑）5 μmol/L，處理細(xì)胞48 h。

1.2.7 外泌體染色和觀察 為了觀察外泌體是否能夠被受體細(xì)胞所吸收，采用外泌體染色試劑PKH26對(duì)外泌體染色3 min，加入血清終止染色，200 000g超速離心2 h，去上清液，100 μl含10%FBS的DMEM用槍頭輕柔重懸。與A549細(xì)胞37℃下共同孵育4 h，對(duì)照組（Con）細(xì)胞加PBS代替外泌體懸液，1.4%多聚甲醛常溫固定15 min，PBS洗滌后DAPI常溫染色15 min，PBS洗三遍，加抗熒光淬滅劑，透明指甲油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察外泌體被細(xì)胞攝取情況。

1.2.8 CCK-8實(shí)驗(yàn) 相同數(shù)量的A549細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后加入100 ml細(xì)胞上清提取外泌體共培養(yǎng)48 h。將共培養(yǎng)細(xì)胞接種于96孔板中，5 000個(gè)/孔，加入不同濃度的CDDP處理48 h，每孔加入含10% CCK-8檢測試劑的培養(yǎng)基，37℃孵育2 h，于波長450 nm處檢測吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率（%）=試驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 細(xì)胞免疫熒光 按照50%的密度接種A549細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后加入不同處理下的外泌體共培養(yǎng)48 h，將正常的A549細(xì)胞及共培養(yǎng)后的A549細(xì)胞按照60%的密度爬片于6孔板中，加入1 μg/ml CDDP處理48 h后進(jìn)行免疫熒光染色。PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次，37℃下加入0.1% Triton X100打孔1 h，PBS清洗2次，加入一抗γ-H2AX（1:400），4℃孵育過夜，PBS清洗2次，加入對(duì)應(yīng)屬性的熒光二抗，37℃孵育1 h，PBS清洗2次，DAPI染核，清洗后脫水封片于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞外泌體的收集與鑒定

透射電子顯微鏡下可見典型的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，見圖1A，NTA顯示其粒徑為30～120 nm，粒徑分布峰型單一，見圖1B。Western blot檢測顯示外泌體中表達(dá)標(biāo)志性蛋白（CD63,CD9,Alix），未檢測到陰性對(duì)照蛋白Calnexin（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合蛋白），見圖1C、1D。

2.2 高表達(dá)APE1的細(xì)胞產(chǎn)生高表達(dá)APE1的外泌體

不同濃度的順鉑處理A549細(xì)胞48 h后，利用CCK-8檢測得出IC50值為2.04±0.39 μg/ml，見圖2A。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)順鉑處理細(xì)胞后，APE1表達(dá)升高（F=28.684,P=0.000），見圖2B。用2 μg/ml順鉑處理A549細(xì)胞48 h后，提取A549細(xì)胞上清中的外泌體（EXOCDDP），Western blot 檢測外泌體APE1蛋白表達(dá)，A549外泌體（EXO）作為對(duì)照，結(jié)果顯示EXOCDDP的APE1蛋白升高（F=3.236,P=0.048），見圖2C。采用慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功構(gòu)建了高表達(dá)APE1的細(xì)胞——A549APE1細(xì)胞（F=3.691,P=0.001），見圖2D，提取A549APE1細(xì)胞外泌體（EXOAPE1），Western blot檢測發(fā)現(xiàn)外泌體APE1蛋白表達(dá)升高（F=2.822,P=0.013），見圖2E。以上結(jié)果表明，高表達(dá)APE1的A549細(xì)胞能夠產(chǎn)生高表達(dá)APE1的外泌體。

2.3 APE1以外泌體包裝的形式被受體細(xì)胞所吸收

共聚焦顯微鏡觀察顯示，與染色后的外泌體共培養(yǎng)后，A549受體細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色PKH26標(biāo)記的外泌體，而對(duì)照組A549細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)紅色信號(hào)，見圖3A。將外泌體與受體細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，Western blot檢測受體細(xì)胞APE1表達(dá)增加（F=32.176,P=0.000），見圖3B。將帶有GST標(biāo)簽的APE1純化蛋白與A549細(xì)胞共同孵育48 h，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)未檢測到外源性的GSTAPE1純化蛋白，見圖3C。以上結(jié)果說明，APE1能夠通過外泌體包裝的方式進(jìn)入細(xì)胞，而非游離蛋白形式。

圖1 A549外泌體的鑒定Figure 1 Identification of A549 exosomes

2.4 外泌體APE1降低受體細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度

將順鉑處理細(xì)胞后產(chǎn)生的外泌體（EXOCDDP）與A549細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞在0.5 μg/ml（F=8.971,P=0.040）、1 μg/ml（F=0.259,P=0.012）、2 μg/ml（F=2.830,P=0.021）、4 μg/ml（F=0.015,P=0.018）、6 μg/ml（F=3.199,P=0.042）順鉑中的存活率明顯升高，見圖4A。將EXOAPE1與受體細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞在1 μg/ml（F=4.359,P=0.004）、2 μg/ml（F=0.153,P=0.009）、4 μg/ml（F=0.603,P=0.028）、6 μg/ml（F=1.285,P=0.018）順鉑中的存活率也明顯升高，見圖4B。以上結(jié)果表明，高表達(dá)APE1的外泌體可以降低細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度。

2.5 APE1的堿基切除修復(fù)功能在外泌體介導(dǎo)的順鉑敏感度改變中發(fā)揮主要作用

圖2 高表達(dá)APE1的A549細(xì)胞產(chǎn)生高表達(dá)APE1的外泌體Figure 2 A549 cells with high expression of APE1 produced exosomes with high expression of APE1

圖3 APE1以外泌體包裹的形式進(jìn)入受體細(xì)胞Figure 3 APE1 entered receptor cells in form of exosomes

圖4 外泌體APE1降低受體細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度Figure 4 Exosome APE1 reduced sensitivity of receptor cells to cisplatin

A549細(xì)胞采用APE1shRNA敲低內(nèi)源性的APE1后（圖5A），與EXOAPE1共培養(yǎng)48 h。分別加入3種APE1功能抑制劑，用CCK-8檢測受體細(xì)胞在順鉑中的存活率，未加抑制劑的細(xì)胞作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，當(dāng)使用inhibitor compound#3抑制劑后，細(xì)胞在0.5 μg/ml（F=0.199,P=0.000）、1 g/ml（F=1.090,P=0.000）、2 μg/ml（F=1.105,P=0.000）、4 μg/ml（F=1.968,P=0.017）順鉑中的敏感度明顯恢復(fù)，見圖5B。進(jìn)一步觀察順鉑刺激下γ-H2AX蛋白（DNA損傷的標(biāo)志蛋白）的表達(dá)情況，免疫熒光顯示，EXOAPE1處理受體細(xì)胞后γ-H2AX減少，使用inhibitor compound#3抑制劑后，γ-H2AX增多，見圖5C，Western blot檢測得到了相似的結(jié)果（F=7.007,P=0.027），見圖5D。

3 討論

以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療仍然是NSCLC的主要治療手段。但是在鉑類方案化療過程中，NSCLC患者卻常常由于受到耐藥的制約而導(dǎo)致化療失敗[9]。近年來，外泌體（一種納米粒徑級(jí)別的膜性小囊泡），由于可通過其囊泡內(nèi)攜帶的多種生物活性物質(zhì)傳遞耐藥性，而引起廣泛關(guān)注[10]。APE1具有DNA損傷修復(fù)和氧化還原雙功能，在NSCLC鉑類耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，然而APE1在外泌體傳遞耐藥過程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。

我們通過對(duì)NSCLC A549細(xì)胞外泌體的檢測發(fā)現(xiàn)，外泌體中確實(shí)存在APE1蛋白的表達(dá)，且在順鉑刺激下，外泌體APE1表達(dá)升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APE1主要是以外泌體包裝的形式被受體細(xì)胞所吸收。為了驗(yàn)證順鉑刺激下外泌體APE1升高的現(xiàn)象是否與NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度相關(guān)，我們構(gòu)建高表達(dá)APE1的外泌體（EXOAPE1），將其與A549細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度明顯下降。以上結(jié)果表明，外泌體中的APE1能夠發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能，降低受體細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度。

圖5 A549受體細(xì)胞順鉑敏感度下降與APE1的堿基切除修復(fù)功能有關(guān)Figure 5 Decrease of sensitivity of A549 receptor cells to cisplatin was related to base excision and repair function of APE1

一些研究顯示，APE1的堿基切除修復(fù)功能在化學(xué)藥物導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[12]，另外一些研究則表明，APE1通過對(duì)一些轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)控[13]，影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。為此我們對(duì)外泌體APE1的功能進(jìn)行了初步探索發(fā)現(xiàn)，分別采用3種不同的APE1功能抑制對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，當(dāng)采用APE1的內(nèi)切酶活性抑制劑（inhibitor compound #3）后，與高表達(dá)APE1外泌體共培養(yǎng)的A549受體細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度得以恢復(fù)。順鉑主要通過損傷腫瘤細(xì)胞DNA，阻止其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。結(jié)果提示，在順鉑的短期刺激下，APE1的堿基切除修復(fù)功能促進(jìn)順鉑導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞的DNA損傷的修復(fù)，從而在外泌體介導(dǎo)的順鉑抵抗中發(fā)揮主要作用。

綜上所述，NSCLC細(xì)胞釋放的外泌體中含有APE1，而順鉑刺激會(huì)增加外泌體的APE1水平，外泌體APE1能夠被A549受體細(xì)胞所吸收，最終導(dǎo)致A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度下降。其中APE1的堿基切除修復(fù)功能可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而鑒于APE1還具有氧化還原調(diào)控、調(diào)節(jié)RNA代謝[14]等多種功能，后續(xù)還需要對(duì)包括腫瘤間質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種不同來源的外泌體APE1的功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，APE1是生物體細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白，對(duì)細(xì)胞的生存和發(fā)展至關(guān)重要，如果將細(xì)胞內(nèi)的APE1敲除，細(xì)胞幾乎無法存活[15]，而靶向外泌體中的APE1或許并不會(huì)影響正常細(xì)胞的功能，因此選擇外泌體APE1作為腫瘤治療的靶點(diǎn)值得深入研究。