苗晉鑫,宋韶鶴,王 崢,苗明三*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué),中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,藥學(xué)部 鄭州 450000)

COVID-19 是一種新的傳染病,由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起的一種呼吸道疾病。 在SARS-CoV-2 跨大洲的快速傳播過程中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種突變,其中兩個(gè)突變(D614G 和S943P)的變異病毒株具有較高的傳染性[1]。 全球疫情仍在持續(xù)蔓延,給人類生命和身心健康帶來嚴(yán)重威脅,同時(shí)對(duì)中國和世界經(jīng)濟(jì)帶來巨大影響,給全球公共衛(wèi)生安全帶來巨大挑戰(zhàn)。 中國科學(xué)家、臨床醫(yī)護(hù)研究人員和基礎(chǔ)科研人員等聯(lián)合世界科學(xué)家快速報(bào)道了一系列針對(duì)COVID-19 的研究,包括臨床特點(diǎn)[2-3]、SARS-CoV-2 的致病原[4]、病毒基因組測序[5-6]、經(jīng)驗(yàn)性的診療方案[7]、抗SARS-CoV-2藥物和疫苗的研發(fā)[8]等。 然而,COVID-19 的發(fā)病機(jī)制不完全清楚,仍然沒有針對(duì)SARS-CoV-2 特異的治療方法及藥物和疫苗。 目前COVID-19 的基礎(chǔ)研究集中在致病機(jī)制、抗SARS-CoV-2 藥物及疫苗的開發(fā)。 動(dòng)物模型的發(fā)展有助于深入了解其發(fā)病機(jī)制,以及加快藥物和疫苗的研發(fā),對(duì)于阻止COVID-19 流行蔓延至關(guān)重要。 本文就近半年來COVID-19 動(dòng)物模型制備情況及各種動(dòng)物模型的特征與使用范圍進(jìn)行總結(jié)分析,為將來優(yōu)化及選擇COVID-19 動(dòng)物模型提供理論參考依據(jù)。

1 非人靈長類COVID-19 動(dòng)物模型

非人靈長類(non-human primates, NHP)動(dòng)物在遺傳學(xué)上與人親緣關(guān)系極其相近,解剖學(xué)、生理學(xué)與病理學(xué)等與人相似。 NHP 動(dòng)物模型一直作為實(shí)驗(yàn)研究的金標(biāo)準(zhǔn),是開展藥物和疫苗臨床前的最后一步。 Yu 等[9]在正式期刊報(bào)道第一篇關(guān)于恒河猴感染SARS-CoV-2 的文章,106TCID50/mL HB-01 SARS-CoV-2 病毒株通過氣管內(nèi)感染青年與老年恒河猴,發(fā)現(xiàn)青年與老年恒河猴體重減輕和虛弱的臨床癥狀；青年與老年動(dòng)物都在呼吸道感染后3 d 病毒載量最高；與青年恒河猴相比, SARS-CoV-2 在老年恒河猴引起更嚴(yán)重的彌漫性間質(zhì)性肺炎與人肺病理學(xué)相似。 研究提示,動(dòng)物年齡可能影響病毒感染后肺疾病的嚴(yán)重程度。 Shan 等[10]采用7×106TCID50的IVCAS 6.7512 SARS-CoV-2 病毒株通過氣管對(duì)恒河猴進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn),在感染后14 d 出現(xiàn)7%～8%體重下降；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測發(fā)現(xiàn)喉嚨感染后1 d 和5 d 病毒載量水平高；組織病理學(xué)顯示彌漫性間質(zhì)性肺炎。 Bao 等[11]和Deng等[12]采用106TCID50/mL 的SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN 病毒株感染恒河猴,得到了與Yu相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 同時(shí),這兩項(xiàng)研究分別發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 可以通過結(jié)膜感染引起較輕微的COVID-19 癥狀和被SARS-CoV-2 感染康復(fù)后的猴子近期不會(huì)再次感染的特征。 另一項(xiàng)研究采用2.6×106TCID50的nCoV-WA1-2020 SARS-CoV-2 病毒株通過氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、眼和口服聯(lián)合接種恒河猴,發(fā)現(xiàn)受感染的恒河猴出現(xiàn)發(fā)燒、呼吸不規(guī)則、食欲不振、外觀蒼白和脫水等癥狀；所有動(dòng)物的鼻、咽拭子以及支氣管灌洗液均能檢測到高水平的病毒載量；肺部CT 顯示明顯的滲透特征；肺組織損傷與COVID-19 患者相似,該動(dòng)物模型反映了中度COVID-19 的臨床癥狀和呼吸道病理[13]。 以上研究顯示不同病毒株和病毒感染途徑可能影響肺的疾病。

由于恒河猴具有與人類相近的免疫系統(tǒng),因此它們對(duì)于測試疫苗或藥物的反應(yīng)將很有用。 中國科研團(tuán)隊(duì)首先報(bào)道SARS-CoV-2 疫苗在臨床前動(dòng)物體內(nèi)的研究結(jié)果,在第0、7 和14 天給恒河猴接種不同劑量(3 μg、6 μg)的PiCoVacc 疫苗,在第22 天時(shí)對(duì)動(dòng)物接種SARS-CoV-2,高劑量組(6 μg)在恒河猴感染后7 d,咽喉、肛門和肺都未檢測到病毒,也沒有觀察到抗體依賴的增強(qiáng)( antibody-dependent enhancement,ADE)現(xiàn)象；肺部組織病理變化顯著減少；接種疫苗的恒河猴均未發(fā)現(xiàn)發(fā)燒和體重減輕等現(xiàn)象；接種疫苗的恒河猴淋巴細(xì)胞亞群比例(CD3+、CD4+和CD8+)以及關(guān)鍵細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5 和IL-6)與對(duì)照組相比均沒有顯著變化[8]。 此外,第29 天,疫苗沒有引起恒河猴的肝、心、脾、肺、腎和腦等顯著病理學(xué)特征。 研究提示,在恒河猴中PiCoVacc 疫苗不僅有保護(hù)作用,還具有安全性。

除了以上研究組開發(fā)的NHP 動(dòng)物模型,其他小組也在努力尋找非人靈長類COVID-19 動(dòng)物模型。Lu 等[14]采用3 種NHP 動(dòng)物,包括恒河猴、食蟹猴和狨猴進(jìn)行感染SARS-CoV-2 的研究。 實(shí)驗(yàn)感染12只恒河猴、6 只食蟹猴和6 只狨猴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)100%(12/12)恒河猴、33.3%(2/6)食蟹猴體溫升高,但是6 只狨猴體溫保持不變。 病毒RNA 在所有猴子的鼻、口咽、肛拭子和血液中均能檢測到。 所有恒河猴和食蟹猴顯示胸部放射異常。 但是在尸檢時(shí),2只狨猴的所有組織中沒有檢測到病毒。 這項(xiàng)研究提示,恒河猴和食蟹獼猴動(dòng)物模型可用來感染研究和療效評(píng)價(jià)。 Rockx 等[15]通過氣管內(nèi)和鼻內(nèi)聯(lián)合接種年輕和成年兩組食蟹猴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有動(dòng)物都產(chǎn)生了SARS-CoV-2 特異性抗體,但沒有觀察到臨床癥狀。 但是通過RT-qPCR 及鼻、咽和直腸拭子病毒培養(yǎng)物檢測,這些動(dòng)物仍被SARS-CoV-2 感染。年輕動(dòng)物鼻拭子檢測到病毒RNA 在感染后2 d 達(dá)到峰值,成年動(dòng)物在感染后4 d 至8 d 時(shí)被檢測到病毒RNA。 四分之一的動(dòng)物出現(xiàn)病毒排出現(xiàn)象與無癥狀人類相似,提示該COVID-19 食蟹猴模型可以模擬無癥狀者攜帶病毒特征。 該研究還比較了感染SARS-CoV-2 的動(dòng)物與感染SARS-CoV、MERSCoV 的動(dòng)物,比較發(fā)現(xiàn)食蟹猴在感染過程中,能較早檢測到SARS-CoV-2。

2 嚙齒類COVID-19 動(dòng)物模型

盡管NHP 動(dòng)物模型在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)和臨床疾病與人有較高的相似性等諸多優(yōu)勢,但是由于價(jià)格昂貴、不易得到和數(shù)量有限等使用并不廣泛。 而嚙齒類動(dòng)物由于價(jià)格便宜、易獲得和使用、數(shù)量充足,且可以進(jìn)行基因修飾等廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 目前,用于COVID-19 動(dòng)物模型有人ACE2(hACE2)轉(zhuǎn)基因小鼠和敘利亞倉鼠(表1)。

2.1 小鼠COVID-19 動(dòng)物模型

Zhou 等[16]對(duì)2019-nCoV(現(xiàn)更名SARS-CoV-2)進(jìn)行了鑒定和表征,揭示其與SARS-CoV 具有79.6%的相同序列。 重要的是,多項(xiàng)研究證明SARS-CoV-2 與SARS-CoV 使用相同的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)受體進(jìn)入細(xì)胞[16-19]。 在嚴(yán)重呼吸綜合癥(SARS)研究中,已經(jīng)開發(fā)了多種hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型[20-22]。 Bao 等[23]采用野生ICR 小鼠和hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)制COVID-19 模型,結(jié)果顯示SARSCoV-2 不感染ICR 小鼠,易感染hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠。 采用105TCID50/50 μL 的HB-01 SARS-CoV-2病毒株通過鼻內(nèi)接種于hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠。 與SARS 研究不同,臨床表現(xiàn)輕微,hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠在感染后5 d 減重8%,并且出現(xiàn)弓背和外部刺激反應(yīng)減弱等癥狀。 RT-qPCR 檢測肺部病毒在感染后3 d 達(dá)到峰值。 感染后21 d,hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測到針對(duì)SARS-CoV-2 S 蛋白的特異性IgG 抗體。病理組織學(xué)顯示間質(zhì)性肺炎,伴有明顯的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲入肺泡間質(zhì),巨噬細(xì)胞積累肺泡腔中。 Perlman 利用重組hACE2 的腺病毒載體感染小鼠使小鼠肺細(xì)胞表達(dá)hACE2 基因,然后再用SARSCoV-2 感染該小鼠模型,發(fā)現(xiàn)小鼠體重減輕20%,并出現(xiàn)翹毛癥狀,但沒有小鼠死亡[24]。 由于疫情所限,小鼠模型開發(fā)不完全,小鼠在遺傳水平可操作和完備的免疫學(xué)試劑有助于對(duì)未來病毒發(fā)病機(jī)理研究。

2.2 敘利亞倉鼠COVID-19 動(dòng)物模型

敘利亞倉鼠對(duì)病毒、寄生蟲等病原微生物極其敏感的特性,使它常用于感染性疾病的研究[25]。Chan 等[26]最先使用敘利亞倉鼠進(jìn)行模型制備,105PUF 100 μL SARS-CoV-2[27]鼻內(nèi)接種敘利亞倉鼠,發(fā)現(xiàn)倉鼠被感染后1～6 d 體重下降約11%；從感染后2 d 開始,動(dòng)物出現(xiàn)了嗜睡、翹毛、駝背以及呼吸急促等癥狀,并在感染后7 d 時(shí)開始恢復(fù),但沒有動(dòng)物死亡。 就臨床體征持續(xù)時(shí)間和隨后的恢復(fù)而言,與人類發(fā)現(xiàn)的輕度至中度疾病發(fā)展相似。 RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)氣道組織中的病毒載量從感染后2 ～7 d逐漸降低,肺組織的病毒載量在感染后2 d 和4 d 最高,腸道中在感染后4 d 最高,這些發(fā)現(xiàn)與人上下呼吸道感染的表型非常相似。 隨后的一項(xiàng)研究,同樣顯示了相似的研究結(jié)果[28]。 此外,該研究還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)感染SARS-CoV-2 的敘利亞倉鼠通過直接接觸能有效地將病毒傳播給未接種病毒的倉鼠,這些被傳染的動(dòng)物也發(fā)展出了輕度至中度的疾病,與接種動(dòng)物相似。 Sia 等[29]研究發(fā)現(xiàn)與近期的報(bào)告一致,確定倉鼠支持病毒復(fù)制,在感染后7 d 時(shí)迅速清除病毒并引起肺細(xì)胞增生。 值得注意的是,該研究證實(shí)SARS-CoV-2 在敘利亞倉鼠之間傳播主要通過氣溶膠而不是通過污染物進(jìn)行的。 Boudewijns 等[30]比較了感染BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020 (EPI ISL 407976|2020-02-03) SARS-CoV-2 病毒株的C57BL/6 小鼠、Ifnar1-/-小鼠、Il28 r-/-小鼠、BALB/c小鼠、SCID 小鼠、敘利亞倉鼠、STAT2-/-敘利亞倉鼠和IL28R-a-/-敘利亞倉鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠的肺感染SARSCoV-2 受到早期I 型干擾素的限制；敘利亞倉鼠允許SARS-CoV-2 感染,并確定STAT2 信號(hào)傳導(dǎo)在病毒感染中起雙重作用,一方面可以加重肺損傷,另一方面又限制了SARS-CoV-2 全身性的傳播。 這些研究提示,敘利亞倉鼠可作為很好的COVID-19 小動(dòng)物模型研究SARS-CoV-2 感染及可能的傳播途徑。

表1 SARS-CoV-2 感染和疾病的動(dòng)物模型Table 1 Animal models for SARS-CoV-2 infection and disease

3 雪貂COVID-19 動(dòng)物模型

雪貂的上下呼吸道解剖比例和支氣管壁粘膜下腺體的密度與人呼吸道狀況非常相似,常用于研究呼吸道病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[32-33]。 Shi 等[31]分別采用105PFU SARS-CoV-2/F13/environment/2020/Wuhan(F13-E) 和SARS-CoV-2/CTan/human/2020/Wuhan(CTan-H) 兩種SARS-CoV-2 病毒株通過鼻內(nèi)接種雪貂。 結(jié)果顯示,感染后的雪貂體溫輕微升高,沒有出現(xiàn)其他臨床癥狀,不會(huì)造成嚴(yán)重疾病或死亡。 兩種病毒感染后8 d 鼻洗液依然能夠檢測到病毒RNA；肺間隔和肺泡腔內(nèi)II 型肺細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量增加。 Kim 等[34]采用105.5 TCID50/mL SARSCoV-2 NMC-nCoV02 病毒株經(jīng)鼻內(nèi)接種雪貂。 盡管該動(dòng)物模型未觀察到死亡現(xiàn)象,但是利用RT-qPCR 在感染后8 d 的雪貂鼻洗液、唾液、尿液和糞便內(nèi)可檢測到病毒RNA。 重要的是,接觸2 d 后,所有直接接觸雪貂的動(dòng)物都檢測到SARS-CoV-2,而相鄰籠中6個(gè)雪貂也有2 個(gè)檢測到病毒。 這些研究提示,雪貂能模仿COVID-19 的傳播動(dòng)物模型。

4 貓COVID-19 動(dòng)物模型

Wan 等[35]基于病毒的S 蛋白與ACE2 蛋白復(fù)合體的三維分子結(jié)構(gòu)預(yù)測模型,發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2能有效識(shí)別貓等其他動(dòng)物的ACE2,這些動(dòng)物的ACE2 蛋白與結(jié)合病毒的關(guān)鍵殘基相同或相似。 先前SARS 的病毒SARS-CoV 研究表明,家貓能夠感染冠狀病毒并將其傳播給其他貓[36]。 Shi 等[31]為了確定從COVID-19 患者分離冠狀病毒(CTan-H)的宿主,經(jīng)鼻內(nèi)將105PFU CTan-H SARS-CoV-2 毒株接種家貓。 感染后3 d,兩只貓?jiān)诒羌?、軟顎、扁桃體、肺、小腸中檢測到病毒RNA,而感染6 d 在兩只動(dòng)物的鼻甲、軟顎、扁桃體,一只動(dòng)物的氣管和另一只動(dòng)物的小腸中檢測到病毒RNA。 對(duì)感染后3 d 和6 d 的貓組織病理學(xué)顯示,鼻、氣管黏膜上皮和肺部有大量病變。 同時(shí),與接種貓同籠的未接種貓也感染了SARS-CoV-2,表明貓容易受到空氣傳播的感染[37]。 需要說明的是,以實(shí)驗(yàn)室高劑量病毒感染后的家貓會(huì)將SARS-CoV-2 傳播給其他貓,暫時(shí)沒有證據(jù)表明自然狀態(tài)家貓能感染人類。

表2 COVID-19 動(dòng)物模型應(yīng)用比較Table 2 Comparison of the applications of COVID-19 animal models

5 結(jié)論與展望

中國學(xué)者和世界科學(xué)家在近半年內(nèi)的共同努力下,COVID-19 動(dòng)物模型開發(fā)和制備取得了巨大的進(jìn)展。 研究人員通過非人靈長類、小鼠、敘利亞倉鼠、雪貂、貓和狗[38]感染SARS-CoV-2 復(fù)制COVID-19 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,其中有些動(dòng)物顯示了不同程度的病理變化及臨床癥狀。 比較分析COVID-19 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型特征(表2),非人靈長類和hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠可用于研究對(duì)COVID-19 治療方案或藥物和疫苗評(píng)估。 轉(zhuǎn)基因敘利亞倉鼠有助于研究限制全身性病毒傳播的分子途徑。 雪貂和家貓擁相對(duì)體型較大的優(yōu)勢,有利于重復(fù)采樣監(jiān)測病毒載量、免疫反應(yīng)等研究。 由于缺乏與COVID-19 患者完全一致的臨床癥狀、病理變化和死亡現(xiàn)象的動(dòng)物模型,研究人員仍在努力探索開發(fā)新的動(dòng)物模型。 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展和對(duì)COVID-19 發(fā)病機(jī)制不斷理解,有望制備對(duì)SARS-CoV-2 更敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 現(xiàn)有COVID-19 動(dòng)物模型雖然不夠完美,只能顯現(xiàn)輕度或中度感染,它們可能無法幫助科研人員了解更嚴(yán)重的病例,但這些輕度感染的動(dòng)物可能用于發(fā)病機(jī)制、測試藥物和疫苗。 針對(duì)現(xiàn)階段COVID-19 動(dòng)物模型,作者認(rèn)為,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適動(dòng)物模型,亦可以多種動(dòng)物模型互補(bǔ)應(yīng)用,更好的對(duì)COVID-19 了解及疫苗和藥物評(píng)價(jià)與篩選。