邱永升,魏 巍,宗小川,周 銳,陳夜茜,王 帥,姚東東,賈英萍*

(1.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院麻醉科 河南省兒童神經(jīng)發(fā)育工程研究中心,鄭州450018； 2.哈佛大學醫(yī)學院附屬布列根和婦女醫(yī)院, 美國 馬薩諸塞 波士頓02101)

腦缺血再灌注引起一系列的病理生理變化導致繼發(fā)性腦組織損傷,包括很多環(huán)節(jié),如炎癥反應興奮性氨基酸的釋放增加、能量障礙、自由基的生成、凋亡基因的激活、細胞內(nèi)鈣的失穩(wěn)態(tài)等。 這些環(huán)節(jié)互為因果,相互聯(lián)系,形成惡性循環(huán),從而導致細胞的凋亡或壞死[1-4]。 其中炎癥反應的發(fā)生發(fā)展起到重要作用,核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)在機體炎癥反應中有著關(guān)鍵的作用,激活后會加重創(chuàng)傷性腦實質(zhì)損害,與其密切相關(guān)的炎性介質(zhì)主要有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukiN-1β,IL-1β)以及白細胞介素-6(interleukiN-6,IL-6)等[5-8]。 腦缺血再灌注可引起NF-κB 的活化,從而可調(diào)控上述介質(zhì)基因的誘導表達。 α2腎上腺素能受體(α2adrenergic receptor,α2-AR)激動劑右美托咪定對腦缺血損傷具有保護作用[9-11]。 本研究擬評價α2-AR激動劑在大鼠局灶性腦缺血再灌注過程中對NF-κB表達的影響,探討α2-AR 激動劑腦保護的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康7 周齡雄性SPF 級SD 大鼠90 只,體重(226±27)g,購于河南省實驗動物中心[SCXK(豫)2017-0001],所有動物在河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房飼養(yǎng)[SYXK(豫)2011-0001],室溫(22±1)℃,12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán),自由獲取食物和水。 動物的使用及操作按照本院動物管理委員會(IACUC2017002)的規(guī)定執(zhí)行,使用實驗動物時嚴格按照,3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

α2-AR 激動劑右美托咪定由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；TNF-α 和IL-1β ELISA 檢測試劑盒由美國Sigma 公司生產(chǎn)；核蛋白提取試劑盒為美國Active Motif 公司產(chǎn)品；電轉(zhuǎn)印裝置為Pharmcia Nova Blot 產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

90 只SD 雄性大鼠,采用數(shù)字表法隨機分為3組,分別為假手術(shù)組(S 組)、缺血再灌注對照組(C組)和α2-AR 激動劑右美托咪定干預組(D 組),每組30 只,每個亞組為6 只,即根據(jù)大鼠缺血再灌注的時間,隨機平均分為5 個亞組(術(shù)后2、6、12、24 、48 h) 。

1.3.2 動物模型建立

采用改良Longa 大腦中動脈線栓法制造大鼠腦損傷模型[7]。 大鼠稱重俯臥位固定腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg,消毒后分離暴露左側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈,采用長度為40 mm、直徑為0.25 ～0.28 mm 的尼龍魚線作栓線,從頸外動脈向頸內(nèi)動脈方向插入大腦中動脈,如遇阻即停(進線長度為18 ～20 mm),S 組線栓深度為10 mm。 大鼠栓塞成功后,在缺血后2 h 將線拔到頸外動脈殘端內(nèi),再進行灌注。 D 組于缺血前30 min 經(jīng)腹腔注射α2-AR 激動劑右美托咪定100 μg/kg(4 μg/mL)。 C 組給予等體積的0.9%生理鹽水。 按照亞組分組再灌注的時間,斷頭取腦,將標本置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測指標

各組大鼠分別在傷后2、6、12、24 及48 h 5 個時相點斷頭取術(shù)側(cè)腦組織加等滲鹽水制備勻漿,離心之后,取上清液1 mL,-80℃保存?zhèn)溆?酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immuno sorbent assay ,ELISA)測定TNF-α 和IL-1β 的含量。 簡述如下:ELISA 微孔板中加入稀釋的標準品以及待測樣品每孔100 μL,設空白對照,37℃水浴1 h, PBST(phosphate buffered solution tween, PBST)洗板5 次,嚴格 參照說明書操作知悉,酶標儀450 nm 處測量吸光度A 值,根據(jù)標準品繪制標準曲線,通過樣本的A 值計算對應TNFα、IL-1β 水平。

1.3.4 免疫印跡分析

各樣本取100 μg 大鼠腦組織標本置于12.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,分離的蛋白隨后經(jīng)電轉(zhuǎn)印裝置轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜,于室溫在封閉液中作用3 h 加入NF-κB p65 抗體,置于4℃孵育過夜,用TTBS (tween tris base buffer solution, TTBS)緩沖液沖洗4 次(15 分/次),再加入二抗羊抗兔IgG,室溫搖動孵育1 h,采用TTBS 緩沖液沖洗后行增強化學發(fā)光反應,把聚偏二氟乙烯膜上顯影的條帶掃描入電腦中,經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理得出對應的灰度值,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比來表示。

1.3.5 水迷宮實驗測定

在模型制備之后的24 以及48 h 時,分別取6只大鼠,將其隨機放到一個象限內(nèi),測定大鼠的逃避潛伏期,即使大鼠都面向池壁,記錄它們在60 s之內(nèi)找到平臺的時間,如果90 s 內(nèi)大鼠未還未找到平臺,則認定該大鼠逃避潛伏期為90 s,每只大鼠測定5 次,并取平均值。

1.3.6 神經(jīng)功能缺陷評分

在模型制備之后的24 以及48 h,將神經(jīng)功能缺陷評分總分設定為10 分,分別取6 只實驗大鼠行神經(jīng)功能缺陷測試,包括反應、協(xié)調(diào)運動能力和警覺性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件分析,正態(tài)分布的計量資料以平均數(shù)±標準差即()表示,多個樣本均數(shù)的比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD法,前后時間點的比較采用配對t 檢驗,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 α2-AR 激動劑對大鼠腦組織NF-κB 表達的影響

S 組、C 組、D 組NF-κB 目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比分別為(0.17±0.012)、(0.54±0.015)、(0.34±0.017),C 組與S 組比較表達高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；D 組目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比低于C 組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),詳見圖1。

2.2 腦組織TNF-α 含量

S 組2、6、12、24 和48 h 5 個時相點腦組織TNFα 含量分別為(2.03±0.06)pg/mg、(2.09±0.05)pg/mg、(2.10±0.02)pg/mg、(2.08±0.06)pg/mg、(2.07±0.03)pg/mg,差異無統(tǒng)計學意義；C 組腦組織TNFα 含量在傷后2、6、12、24 及48 h 含量分別為(6.01±0.25)pg/mg、(6.47±0.46)pg/mg、(6.72±0.37)pg/mg、(6.85±0.51)pg/mg、(6.99±0.32)pg/mg,比S 組高(P＜0.05)；D 組腦組織TNF-α 含量在傷后2、6、12、24、48 h 含量分別為(4.17±0.27)pg/mg、(4.25±0.23)pg/mg、(4.11±0.45)pg/mg、(4.09±0.53)pg/mg、(3.87±0.54)pg/mg,比S 組高(P ＜0.05),比C 組低(P＜0.05),見圖2。

2.3 腦組織IL-1β 含量

S 組2、6、12、24、48 h 5 個時相點腦組織IL-1β 含量含量分別為(4.12±0.05)pg/mg、(4.27±0.07)pg/mg、(4.61±0.06)pg/mg、(4.24±0.05)pg/mg、(4.38±0.08)pg/mg,差異無統(tǒng)計學意義；C 組腦組織IL-1β水平在傷后2、6、12、24、48 h 含量分別為(8.35±0.80)pg/mg、(8.26±0.71)pg/mg、(8.53±0.12)pg/mg、(8.62±0.24)pg/mg、(8.79±0.21)pg/mg,比S 組高(P＜0.05)；D 組腦組織IL-1β 水平在傷后2、6、12、24、48 h 含量分別為(5.67±0.62)pg/mg、(5.74±0.90)pg/mg、(5.82±0.53)pg/mg、(5.91±0.19)pg/mg、(5.56±0.27)pg/mg,比S 組高(P＜0.05),比C 組低(P＜0.05)。 見圖3。

2.4 神經(jīng)功能缺陷評分和逃避潛伏期

模型制備后24 h S 組、C 組和D 組神經(jīng)功能缺陷評分分別為(0.35±0.05)分、(5.43±0.29)分、(2.25±0.25)分,模型制備后48 h 神經(jīng)功能缺陷評分分別為(0.30±0.06)分、(4.64±0.60)分、(1.46±0.31)分,與S 組相比,C 組和D 組神經(jīng)功能缺陷評分高(P＜0.05),模型制備后24 h S 組、C 組和D 組逃避潛伏期分別為(18.7±4.4)s、(60.2±6.2)s、(52.2±3.5)s,模型制備后48 h 逃避潛伏期分別為(16.4±5.3)s、(56.4±4.3)s、(44.5±6.7)s,與S 組相比,C 組和D 組逃避潛伏期延長(P＜0.05),D 組高于C 組(P＜0.05)。 見圖4、圖5。

3 討論

本研究參照文獻[12]采用改良Longa 大腦中動脈線栓法制造大鼠腦損傷模型,研究結(jié)果顯示,實驗組和干預組在腦損傷后各時間點2、6、12、24、48 h NF-κB、TNF-α 和IL-1β 均 較 對 照 組 顯 著 升 高(P＜0.05),說明大鼠腦損傷模型制備成功。 NF-κB是一種可誘導的、具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子,能夠啟動編碼IL-1β、IL-6 以及TNF-α 等全身性炎癥反應綜合癥的細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,而NF-κB 的過度活化,能夠引起多種炎癥反應的相關(guān)基因表達上調(diào),從而導致產(chǎn)生大量細胞因子和炎癥遞質(zhì)[13-14]。 研究表明腦缺血再灌注損傷可激活NF-κB,還可引起大鼠腦神經(jīng)細胞凋亡,使其與IKB 解體進入細胞核內(nèi),在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控著炎癥的表達,改變基因外炎性刺激的應答性和炎癥細胞的反應性,也是合成炎性介質(zhì)、啟動其瀑布式級聯(lián)反應的傳導通路中心環(huán)節(jié)。 阻斷NF-κB 的表達,能夠使缺血再灌注大鼠模型心臟的梗死灶有明顯的縮小,這也提示它能夠控制缺血再灌大鼠的細胞死亡,通過激活NF-κB 從而引起大量炎性遞質(zhì)的釋放,因此對于缺血再灌注損傷所引起的腦血管事件來說,可以通過阻斷NF-κB 信號通路,從而改善結(jié)局。 研究發(fā)現(xiàn)α2-AR 激動劑右美托咪定具有神經(jīng)保護的作用[15]。 本研究結(jié)果顯示在各時間點假手術(shù)組的各項檢測指標均無明顯的變化,而腦外傷組在傷之后的5 個時間點檢測指標NF-κB、TNF-α 及IL-1β 均明顯高于相對應時間點假手術(shù)組的數(shù)據(jù)(P＜0.05),并且呈現(xiàn)一個上升的趨勢,而在干預組,檢測指標NF-κB、TNF-α 及IL-1β 均比腦外傷組要低(P＜0.05),這也說明α2-AR 激動劑能夠降低腦損傷時NF-κB 的表達,并且抑制了炎性因子TNF-α 以及IL-1β 的釋放,從而減少了神經(jīng)元的損傷,也減輕了繼發(fā)性的腦損傷的結(jié)局,通過大鼠的逃避潛伏期及大鼠神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果,也可推測α2-AR 激動劑具有腦保護的作用。 有研究認為α2-AR 激動劑右美托咪定主要通過結(jié)合α2腎上腺素受體的亞型,從而起到神經(jīng)保護的作用[16],其機制可能與其具有抗炎作用有關(guān),即藥物激動神經(jīng)元突觸前上的α2腎上腺素能受體,通過介導G 蛋白,從而抑制磷脂酶C 的活性以及鈣離子的內(nèi)流,以降低血漿兒茶酚胺的濃度,增強了副交感神經(jīng)效應,抑制機體的炎性反應,進而發(fā)揮其抗凋亡作用,并改善血腦屏障的通透性,減少細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流,從而抗缺血再灌注損傷。 本研究中α2腎上腺素受體激動劑調(diào)低了NFκB 信號通路上的分子蛋白表達,減少了炎性因子TNF-α 和IL-1β 的釋放,抑制炎性反應,減輕了神經(jīng)功能的損傷狀態(tài),起到了神經(jīng)保護作用,大鼠神經(jīng)功能行為學結(jié)果也與之相吻合。

綜上所述,α2-AR 激動劑能夠調(diào)低大鼠缺血再灌注損傷之后NF-κB 的表達,抑制了機體炎性因子釋放,具有腦保護作用。

圖1 大鼠腦組織NF-κB 目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比的結(jié)果比較Note.GAPDH, glyceraldehydes-phosphate dehydrogenase.Group S, Sham operation group.Group C, Ischemia-reperfusion control group.Group D, α2 adrenergic receptor agonist intervention group.Compared with group S,* P＜0.05.Compared with group C,# P＜0.05.Figure 1 Ratio of NF-κB expression to expression of an internal reference protein in rat brain tissue

圖2 3 組大鼠各時點腦組織TNF-α 含量的比較Note.Group S, Sham operation group.Group C, Ischemiareperfusion control group.Group D, α2 adrenergic receptor agonist intervention group.Compared with group S,* P ＜0.05.Compared with group C,# P＜0.05.The same as below.Figure 2 Comparison of TNF-α in brain tissue at each time point among three groups

圖3 3 組大鼠各時點腦組織IL-1β 含量的比較(,pg/mg)Figure 3 Comparison of IL-1β expression in brain tissue at each time point among the three groups

圖4 3 組大鼠模型神經(jīng)功能缺陷評分比較(,n=6)Figure 4 Comparison of neurological deficit scores among the three groups

圖5 3 組大鼠模型逃避潛伏期比較( ,n=6)Figure 5 Comparison of escape latency among the three groups