黃飛日 蘇忠良 楊知帆

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身性骨骼疾病，與年齡、性別、遺傳等因素相關[1-2]，其特征是骨量減少和微結(jié)構破壞，骨脆性和骨折易感性增加[3]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松性相關疾病的發(fā)病率和病死率逐年提高，且治療成本巨大，將是醫(yī)療保健系統(tǒng)的一個巨大負擔[4]，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。絕經(jīng)后婦女是罹患骨質(zhì)疏松癥的重要人群，其發(fā)病概率遠大于男性，主要是由于雌激素缺乏所致。雌激素的缺乏將導致骨吸收與骨生成穩(wěn)態(tài)被打破，造成骨微結(jié)構破壞、骨量減少、骨強度下降，從而導致骨質(zhì)疏松[5]。通過手術摘除卵巢的方法可有效制備骨質(zhì)疏松癥動物模型[6]。去甲斑蝥素是我國傳統(tǒng)中藥斑蝥素的重要衍生物、蛋白磷酸酶2抑制劑[7]?，F(xiàn)已證實去甲斑蝥素可抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡[8-10]，并且可通過抑制蛋白磷酸酶2促進成骨細胞生成和抑制骨吸收[11]。本研究觀察去甲斑螯素對去勢骨質(zhì)疏松癥小鼠骨微結(jié)構的影響，探討其防治骨質(zhì)疏松癥的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 去甲斑螯素購自北京百奧萊博科技有限公司；無水乙醇購自上海麥克林生化科技有限公司；甲醛、0.9%氯化鈉注射液、水合氯醛均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；1 ml注射器購自北京英偉達科技有限公司。電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司，顯微CT機購自比利時SkyScan公司。

1.2 實驗動物和分組 雌性C57BL-6J 2月齡小鼠40只，體重（21±2）g，所有小鼠均購自蘇州大學實驗動物中心。予自來水和無菌飼料喂養(yǎng),墊料隔天換1次，晝夜各12 h。將40只小鼠按隨機數(shù)字表法分成低劑量組、高劑量組、假手術組和去卵巢組4組，每組10只。實驗經(jīng)溫州市人民醫(yī)院倫理委員會批準，嚴格遵循實驗動物護理和使用指南。

1.3 動物造模制作 各組小鼠采用3.6%水合氯醛按0.01 ml/g濃度腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，在小鼠背部備皮，碘伏消毒，于兩側(cè)髂嵴水平處沿后正中線向上作一縱形皮膚切口，長約1 cm，鈍性分離皮下組織、肌肉，切開深處腹膜，進入腹腔后充分暴露手術視野，可見粉紅色桑葚樣卵巢及淡紅色輸卵管，將其鈍性游離。去卵巢組、低劑量組和高劑量組小鼠建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，即在距卵巢5 mm處結(jié)扎輸卵管及伴隨血管，切除卵巢及周圍脂肪組織，然后按相同的方法摘除對側(cè)卵巢，在確保摘除雙側(cè)卵巢后，逐層縫合腹膜及皮膚，碘伏消毒，予以青霉素1萬U肌肉注射預防感染。假手術組小鼠麻醉后切開皮膚，不做其他處理即予以縫合、消毒并肌肉注射青霉素（劑量同上）。

1.4 藥物干預 卵巢摘除術后每周小鼠稱體重1次，并于第8周起開始給藥干預。將相應劑量的去甲斑螯素[低劑量組小鼠為10 mg/（kg·d），高劑量組小鼠為20 mg/（kg·d）]充分溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液并注入腹腔，連續(xù)4周，每周按照體重變化及時調(diào)整給藥劑量。假手術組和去卵巢組均予0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1.5 骨微結(jié)構指標檢測 給藥干預4周后，用頸椎脫臼法處死各組小鼠，取小鼠完整股骨，剝離附著的肌肉及結(jié)締組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，然后保存于70%乙醇溶液中。檢查時，將小鼠股骨取出，紙巾吸除多余溶液，用紗布隔開，置于顯微CT機泡沫盒中，掃描參數(shù)設置：電壓 50 kV，電流 200 μA，過濾片 0.5 mmAl，掃描精度為9 μm。圖片經(jīng)過3D重建后，觀察小鼠股骨遠端骨微結(jié)構變化并分析其相關參數(shù)：（1）骨小梁骨密度；（2）骨體積分數(shù)（BV/TV）：感興趣區(qū)內(nèi)骨組織體積除以總體積，是標化后的骨體積參數(shù)；（3）骨小梁數(shù)量（Tb.N）：用單位體積內(nèi)骨小梁數(shù)量，來反映骨小梁數(shù)量變化；（4）骨小梁間隔（Tb.Sp）：單位體積內(nèi)骨小梁之間的間隔，體現(xiàn)多孔骨組織骨小梁間距離；（5）骨小梁厚度（Tb.Th）：單位體積內(nèi)骨小梁的厚度，描述骨小梁厚度的變化。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。圖像分析軟件采用Image.Pro Plus 5.1軟件包。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

去卵巢組骨小梁骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均低于假手術組，Tb.Sp高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；低劑量組與高劑量組骨小梁骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均高于去卵巢組，Tb.Sp均低于去卵巢組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖1、表1。

3 討論

圖1 各組小鼠股骨遠端顯微CT圖像

表1 各組小鼠股骨遠端區(qū)域骨微結(jié)構指標比較

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身性骨病，骨量和骨密度下降是本病的主要特征，正常骨代謝是破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成之間的動態(tài)平衡[12-13]，成骨細胞活性降低以及破骨細胞的過度形成和活化是導致骨量和骨密度下降的主要因素[14]。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要危險因素，雌激素可直接作用或通過成骨及破骨細胞的雌激素受體[15]間接調(diào)節(jié)骨基質(zhì)蛋白（酸溶原膠原蛋白等）、細胞因子（IL-1、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β 等）和轉(zhuǎn)錄因子等促進成骨，抑制蛋白水解酶的產(chǎn)生和骨吸收[16]。因此，雌激素水平的降低可導致骨形成受抑，骨吸收亢進，使骨代謝的穩(wěn)態(tài)被打破，導致骨密度的降低、骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本實驗中在摘除小鼠卵巢后，股骨遠端骨量顯著丟失，骨微結(jié)構嚴重破壞。

蛋白磷酸酶2是一種主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是由結(jié)構亞單位A、調(diào)節(jié)亞單位B和催化亞單位C構成的異三聚體，廣泛參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾、細胞周期調(diào)節(jié)等多種細胞活動過程[17]。且據(jù)文獻報道，蛋白磷酸酶2選擇性抑制劑可通過抑制核因子 κB（NF-κB）受體活化因子配體誘導的 NF-кB 和c-Jun N-末端激酶信號通路來抑制破骨細胞生成并減輕破骨細胞的吸收[18]。去甲斑蝥素作為一種蛋白磷酸酶2抑制劑，本文旨在研究其對去勢小鼠骨微結(jié)構的影響，探討其防治骨質(zhì)疏松癥的可行性。

通過摘除小鼠雙側(cè)卵巢后成功建立了小鼠骨質(zhì)疏松模型，予以一定濃度去甲斑螯素干預4周后，采用顯微CT三維重建小鼠股骨遠端骨小梁微結(jié)構，觀察和分析評估小鼠股骨遠端骨小梁骨密度、Tb.N、Tb.Th、Th.Sp，表明去甲斑螯素可以有效保護摘除卵巢后引起的骨量丟失，通過劑量依賴性減少骨微結(jié)構的破壞和丟失。

綜上所述，去甲斑螯素明顯改善了去勢骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨微結(jié)構，減少了骨量的丟失，是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在選擇。