劉穎 許文俠 黃彩群 王華斌

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種鏡下呈螺旋狀或短桿狀的革蘭陰性菌。在Hp發(fā)現(xiàn)之前，人們一直認(rèn)為胃內(nèi)是無(wú)菌環(huán)境，因?yàn)楦呶杆岘h(huán)境能抑制來(lái)自口腔的微生物生長(zhǎng)，但Hp的發(fā)現(xiàn)改變了這種觀念。事實(shí)上胃內(nèi)的菌群比想象中要復(fù)雜多樣化。有數(shù)據(jù)顯示胃內(nèi)微生物密度為10～103CFU/g[1]。Hp是消化性潰瘍、胃癌和黏膜相關(guān)性淋巴組織瘤的重要病原菌，WHO組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其確定為Ⅰ類致癌因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球有超過(guò)50%的人感染Hp。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)成人中Hp感染率達(dá)到40%～60%[2]。Hp的致病機(jī)制目前尚不明確，但越來(lái)越多的研究顯示，胃部疾病的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境、宿主和細(xì)菌等多種因素共同作用的結(jié)果。Hp作為胃內(nèi)重要的致病菌，是否對(duì)胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)和豐度有影響？基于此，本研究選取了慢性淺表性胃炎患者的胃黏膜組織標(biāo)本，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)16S rRNA基因序列，獲得胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)和豐度，探討Hp感染對(duì)胃內(nèi)菌群的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年10月至2018年6月金華市中心醫(yī)院收治的因胃部不適行胃鏡檢查的患者38例，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者胃鏡檢查前4周內(nèi)未使用過(guò)抗生素、抑酸制劑、鉍劑等影響胃內(nèi)菌群的藥物；未接受過(guò)胃腸手術(shù)?；颊呔羧∥葛つそM織標(biāo)本，經(jīng)病理學(xué)檢查均診斷為慢性淺表性胃炎?；颊呶葛つそM織病理學(xué)檢查和細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果中任一項(xiàng)為Hp陽(yáng)性，則歸為Hp陽(yáng)性組（Hp-P組）；兩者都為陰性，則歸為Hp陰性組（Hp-N組）[3-4]。Hp-P組患者14例，其中男8例，女6例，年齡（45.07±9.72）歲；Hp-N組患者24例，其中男9例，女15例，年齡（51.71±10.45）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 哥倫比亞血平板（法國(guó)梅里埃公司）；微需氧袋（法國(guó)梅里埃公司）；腦心浸出液（英國(guó)Oxoid公司）；QIAamp?DNA Mini Kit（德國(guó)QIAGEN公司）；2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊公司）；VAHTS DNA Clean Beads（南京諾唯贊公司）；Qubit dsDNA HS Assay Ki（t美國(guó)ThermoFisher公司）；kapa library quantification Ki（t美國(guó)KAPA Biosystems公司）；Phix Control V3（美國(guó)Illumina公司）；MiSeq Reagent Kit v3（美國(guó)Illumina公司）。DNP-9022恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏公司）；G8800A 型PCR儀（美國(guó)Aglient公司）；QPCR儀（瑞士Roche公司）；Miseq型NGS測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

1.2.2 標(biāo)本采集 胃鏡下分別鉗取患者胃竇黏膜組織3塊，大小1 mm×2 mm。1塊做病理學(xué)檢查，1塊做細(xì)菌培養(yǎng)，1塊置于無(wú)菌凍存管中，于-80℃環(huán)境保存。

1.2.3 基因組DNA提取和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序 胃黏膜組織中加入0.9%氯化鈉溶液200 μl，用組織研磨棒將組織研磨成勻漿，使用QIAamp?DNA Mini Kit提取總DNA，參照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。16S rRNAV3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：PF（5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 RF（5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。反應(yīng)體系（25 μl）：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μl，上下游引物（10 μmon/L）各 1 μl，DNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3min；25次循環(huán) 95℃ 30 s，55℃ 30s,72℃ 45s;72℃ 5min。PCR產(chǎn)物質(zhì)檢及純化后片段大小應(yīng)為550 bp左右。將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行添加特異性標(biāo)簽序列PCR（Index PCR）構(gòu)建PCR文庫(kù)，對(duì)PCR文庫(kù)進(jìn)行純化和質(zhì)檢，16s V3～V4文庫(kù)片段大小應(yīng)為630 bp左右。對(duì)質(zhì)檢和定量合格的文庫(kù)上機(jī)測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理用軟件cutadapt（v1.11）將原始數(shù)據(jù)PE（paired-end）去引物，以確保數(shù)據(jù)是目標(biāo)片段。用軟件 pandaseq（v2.9）將不含引物 PE（paired-end）序列拼接成長(zhǎng)tags。對(duì)拼接長(zhǎng)tags進(jìn)行質(zhì)控（python3腳本）：去除低質(zhì)量序列（平均質(zhì)量值低于Q20，含有模糊堿基N）；去除長(zhǎng)度在300～480 bp以外的序列。用軟件vsearch（v2.4.1_linux_x86_64）對(duì)高質(zhì)量長(zhǎng)序列進(jìn)行去嵌合體。對(duì)去除嵌合體的高質(zhì)量數(shù)據(jù)按相似度0.97進(jìn)行OTU聚類，挑選代表序列。使用rdp-classifier（v2.11）對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋。使用qiime流程得到OTU豐度表和物種豐度表。

1.3 觀察指標(biāo) 采用稀釋曲線反映測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性。胃內(nèi)菌群的豐度和多樣性采用α多樣性分析，用指數(shù)Chao1、Shannon和Simpson來(lái)描述。胃內(nèi)菌群之間的物種組成相似性的分析用PCoA來(lái)描述，采用ANOSIM分析。PCoA是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值。PCoA可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，結(jié)果是數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn)，它沒(méi)有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)，通過(guò)PCoA可以觀察個(gè)體或群體間的差異。采用相關(guān)性三角熱圖分析Hp-P組患者胃內(nèi)菌群相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群豐度和多樣性比較 由稀釋曲線可見(jiàn)，Hp-P組患者胃內(nèi)細(xì)菌物種的豐度明顯低于Hp-N組，見(jiàn)圖1。α多樣性分析可見(jiàn)，Hp-P組和Hp-N組的Shannon指數(shù)分別為（0.97±0.78）和（5.36±0.76），Simpson 指數(shù)分別為（0.19±0.17）和（0.93±0.06），Chao1 指數(shù)分別為（287.21±70.66）和（646.92±156.07）。Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群多樣性上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），Hp-P組患者胃內(nèi)菌群的多樣性明顯低于Hp-N組。

圖1 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群稀釋曲線

2.2 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相似性分析 PCoA分析結(jié)果顯示，Hp-P組和Hp-N患者胃內(nèi)菌群明顯聚集在兩個(gè)不同的區(qū)域。ANOSIM分析結(jié)果顯示，R=0.988，P=0.001，Hp-P組與 Hp-N 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。這說(shuō)明Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，而兩組之間菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

2.3 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群組成分析 在門水平，Hp-N組相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)物種分別為Proteobacteria（30.26%）、Bacteroidetes（27.56%）、Firmicutes（24.61%）、Actinobacteria（5.2%）、Fusobacteria（4.6%）、Unknown;Other（3.0%）、k__Bacteria;Other（2.7%）；Hp-P組相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)物種分別為Proteobacteria（93.7%）、Bacteroidetes（2.5%）、Firmicutes（1.9%）。在屬水平，Hp-N組相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)物種分別為Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）、Sphingomonas（4.6%）、Veillonella（4.6%）、Methylobacterium（4.6%）、Porphpyromonas（3.5%）、Fusobacterium（3.1%）、Rothia（2.5%）、Gemella（1.8%）、Granulicatella（1.3%）、Leptotrichia（1.2%）、Bacteroides（1.2%）、Actinomyces（1.1%）；Hp-P組相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)物種分別為Helicobacter（89.1%）、Prevotella（1.2%）、Methylobacterium（1.1%）、Sphingomonas（1.1%）。見(jiàn)圖 3（插頁(yè)）。

兩組間物種相似性分析，在門水平，Hp-P組Proteobacteria明顯高于Hp-N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria、Fusobacteria在Hp-N組中明顯高于Hp-P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在屬水平，Hp-N和Hp-P兩組物種差異比較，Hp-N 組Prevotella、Streptococcus、Neisseria、Haemophilus、Sphingomonas明顯高于Hp-P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 4（插頁(yè)）。

Hp-P和Hp-N兩組菌落結(jié)構(gòu)相似性分析結(jié)果說(shuō)顯示，Hp-N 組的優(yōu)勢(shì)菌為：Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）；Hp-P組的優(yōu)勢(shì)菌為Helicobacter（89.1%）。

圖2 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群差異性分析（a：PCoA分析；b：ANOSIM分析）

圖3 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群組成分析（a：門水平；b：屬水平）

圖4 Hp-P組與Hp-N組患者胃內(nèi)菌群比較柱狀圖（a：門水平；b：屬水平菌群）

2.3 Hp-P組患者胃內(nèi)菌群相關(guān)性分析 通過(guò)分析物種在不同樣品的豐度變化一致性情況，推測(cè)Hp-P組患者胃內(nèi)菌群之間的作用關(guān)系。相關(guān)性三角熱圖可看到Helicobacter與其他菌群呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明當(dāng)胃內(nèi)有Hp定植后，會(huì)影響其他菌群在胃內(nèi)的定植，使其他菌群在胃內(nèi)定植減少，Hp成為唯一的優(yōu)勢(shì)菌。

3 討論

自1983年Marshall和Warren醫(yī)生發(fā)現(xiàn)Hp后，人們改變了胃內(nèi)是無(wú)菌環(huán)境的觀念[5]。隨著研究的深入，人們了解到胃內(nèi)除了Hp以外還有其他細(xì)菌定植。以前對(duì)胃內(nèi)菌群的研究多采用培養(yǎng)方法，但胃內(nèi)細(xì)菌量少且很多細(xì)菌在體外難培養(yǎng)，因此限制了人們對(duì)胃內(nèi)菌群的認(rèn)識(shí)。16S rRNA基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長(zhǎng)度約為1 542 bp，分子大小適中，突變率小，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最常用和最有用的標(biāo)志[6]。16S rRNA基因序列包括9個(gè)可變區(qū)和10個(gè)保守區(qū)，保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。因此通過(guò)檢測(cè)16S rRNA基因序列，人們能了解到研究樣品的物種分類、物種豐度以及系統(tǒng)進(jìn)化。近幾年第二代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，為16S rRNA基因檢測(cè)提供了有效的檢測(cè)手段。本研究選取了38例慢性胃炎患者，經(jīng)病理學(xué)檢查診斷均為慢性淺表性胃炎。將其分為兩組，Hp-N組24例和Hp-P組14例，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)16S rRNA基因序列，探討Hp感染對(duì)慢性淺表性胃炎患者胃內(nèi)菌群的影響。研究結(jié)果顯示Hp陽(yáng)性的慢性淺表性胃炎患者，胃內(nèi)菌群的豐度和多樣性都明顯的低于Hp陰性的慢性淺表性胃炎患者。該結(jié)果與之前研究結(jié)果相符[7-8]。有研究顯示，Hp感染的兒童患者胃內(nèi)菌群的豐度和多樣性同樣也明顯降低[9]。說(shuō)明Hp感染無(wú)論在兒童還是成人都會(huì)明顯降低胃內(nèi)菌群的豐度和多樣性。

胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)分析，本研究結(jié)果顯示，在門水平Hp-N組的優(yōu)勢(shì)菌群為Proteobacteria（30.26%）、Bacteroidetes（27.56%）、Firmicutes（24.61%）、Actinobacteria（5.20%）、Fusobacteria（4.56%），占菌群的 90%以上；在屬水平Hp-N組的優(yōu)勢(shì)菌群為Prevotella（14.5%）、Streptococcus（10.1%）、Neisseria（7.1%）、Haemophilus（6.5%）、Sphingomonas（4.6%）、Veillonella（4.6%）、Methylobacterium（4.6%），占總菌群的50%。研究顯示，健康人群中胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群在門水平為Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria；在屬水平為Streptococcus[10-12]。該結(jié)果提示慢性淺表性胃炎患者胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)與正常人群相似，但優(yōu)勢(shì)菌群的豐度發(fā)生了變化。有研究指出，在胃癌高發(fā)地區(qū)，Hp陰性的胃炎組，在門水平的優(yōu)勢(shì)菌群為Firmicutes、Fusobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria；在屬水平Hp陰性的胃炎組，明顯增高的菌群為Streptococcus sp和Haemophilus parainfluenzae[7]。說(shuō)明不同地區(qū)慢性淺表性胃炎患者胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的豐度有差異。本研究中Hp-N組豐度最高的是Prevotella。Prevotella是一種口腔內(nèi)常見(jiàn)菌群，可引起牙周炎等感染性疾病。近年來(lái)，Prevotella被證實(shí)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，隨著Prevotella相對(duì)豐度升高，炎癥反應(yīng)程度會(huì)加重[13]。Streptococcus和Neisseria在本研究中Hp-N組豐度也較高。多項(xiàng)研究顯示，Streptococcus感染與胃癌發(fā)生有關(guān)[14]。在Hp-P組Helicobacter是唯一優(yōu)勢(shì)菌群，其他菌群的豐度都較Hp-N組降低。但有研究顯示，Prevotella、Fusobacterium、Nesseria、Veillonella的相對(duì)豐度在Hp陽(yáng)性組明顯升高[8]。這可能與選擇的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組不同有關(guān)，該研究是以健康人群為對(duì)照組，以Hp陽(yáng)性為實(shí)驗(yàn)組，而未考慮胃部的疾病狀況。

Hp是胃癌的高危因素，但只有不到3%的Hp感染者會(huì)發(fā)展成胃癌，Hp根治并不能完全避免胃癌的發(fā)展。研究顯示在胃癌的發(fā)展過(guò)程中Hp的定植量逐漸減少，甚至消失，但胃癌組織菌群的豐度和多樣性卻明顯較癌旁明顯增加[15]。腸化生是胃癌發(fā)生的癌前病變，研究者發(fā)現(xiàn)Hp陰性的腸化生患者Rhizobiales增多，宏基因組分析觀察到腸化生患者的胃組織內(nèi)T4SS基因增多，因此T4SS蛋白的高表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示Hp感染會(huì)降低慢性淺表性胃炎患者胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)和豐度，但未探討Hp感染對(duì)癌前病變腸化生階段胃內(nèi)菌群的影響，也未能進(jìn)一步探討Hp導(dǎo)致胃癌的作用機(jī)制。這啟發(fā)了筆者今后的研究方向。