柴娟 包云( 通訊作者) 劉鴻 師帥 鄭群 鄒立波 毛佳婷

( 金華市人民醫(yī)院生殖中心 浙江 金華 321000)

在輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中多胎妊娠率與移植胚胎的數(shù)目是密不可分的，即兩者之間存在著正相關(guān)的關(guān)系。近十年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展和完善，臨床著床率有了顯著的提高，同時單囊胚的妊娠率也保持較高的水平[1-2]。因此，與十多年前相比多胎妊娠率有了很大的改善[3]。然而，即使移植兩個胚胎也會導(dǎo)致雙胎出現(xiàn)的可能性，這就大大的加重了母親和孩子的危險性。例如，雙胎大腦的發(fā)病率是單胎的七倍之高[4]。因此單囊胚移植越來越被提倡，然而在實(shí)際操作中，有許多原因?qū)е禄颊咴诘谌鞗]有胚胎可用。基于以上原因，本研究的目的在于探討第三天廢棄胚胎在輔助生殖中作用，從而增加冷凍和移植的囊胚數(shù)目，以提高不育夫婦懷孕的機(jī)會；并探討廢棄胚胎的細(xì)胞數(shù)目與囊胚形成之間的關(guān)系，從而為挑選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植提供依據(jù)。

1.資料與方法

1. 一般資料

收集2016 年10 月—2018 年在金華市人民醫(yī)院行第三天胚胎繼續(xù)培養(yǎng)826 名患者共8209 個廢棄胚胎的資料，進(jìn)行回顧性分析。

1.2 治療方法回顧

（1）胚胎繼續(xù)培養(yǎng)技術(shù)：采用Vitrolife 序貫培養(yǎng)液將廢棄胚胎（2PN、1PN 和0PN）培養(yǎng)至第五天或第六天，并在D5 或D6 早上進(jìn)行囊胚評估。

（2）囊胚激光打孔技術(shù)：將D5 和D6 形成的可用囊胚行激光法，即遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置，選擇滋養(yǎng)層較薄處進(jìn)行激光處理，通常在5 分鐘內(nèi)囊胚腔完全皺縮。

（3）囊胚冷凍技術(shù)：采用加藤試劑，對可用囊胚進(jìn)行玻璃化快速冷凍。

1.3 胚胎評價標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

（1）D3 胚胎評價標(biāo)準(zhǔn)：D3 胚胎細(xì)胞數(shù)目：分為＜7細(xì)胞、 7 ～9 細(xì)胞（7 細(xì)胞、8 細(xì)胞以及9 細(xì)胞）、＞9細(xì)胞。

（2）形成囊胚評價標(biāo)準(zhǔn)：形態(tài)評定基于Gardner 法，同時評定囊胚擴(kuò)張程度以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和滋養(yǎng)外胚層（TE）的發(fā)育情況。將優(yōu)質(zhì)（3AA、4AA、5AA、3AB/BA，4AB/BA 和5AB/BA）和中等質(zhì)量（3AC/BC/CA/CB，4AC/BC/CA/CB 和5AC/BC/CA/CB）的第五/六天擴(kuò)張囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存，而低質(zhì)量囊胚（3CC，4CC 和5CC）則被排除和丟棄。

（3）觀察指標(biāo)：比較不同D3 胚胎細(xì)胞數(shù)目的囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計量資料，各組間的統(tǒng)計分析采用t分析，計數(shù)資料以（%）表示，行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 廢棄胚胎囊胚培養(yǎng)的結(jié)果

將826 名患者共8209 個廢棄胚胎進(jìn)行延續(xù)培養(yǎng)至D5/D6，共形成1371 個囊胚，總囊胚形成率為16.7%（1371/8209），總可用囊胚形成率為14.83%（1218/8209），總優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為11.57%（950/8209）。

2.2 分析各因素與囊胚形成率的關(guān)系

（1）將年齡分為三個階段，即＜30歲、30～34歲及＞34歲，各年齡組總囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，中等質(zhì)量囊胚形成率和棄去囊胚率有一定的差異，但是無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 患者年齡與囊胚形成率[n（%）]

（2）將形成的可用囊胚按細(xì)胞數(shù)分組，即細(xì)胞數(shù)＜7、7 ～9 細(xì)胞及＞9 細(xì)胞組，7 ～9 細(xì)胞的囊胚形成率和＞9 細(xì)胞組明顯高于細(xì)胞數(shù)＜7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；7 ～9 細(xì)胞組比＞9 細(xì)胞組的囊胚形成率高，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 患者形成囊胚與胚胎細(xì)胞數(shù)目的關(guān)系

（3）分析具體細(xì)胞數(shù)目，即7 細(xì)胞組、8 細(xì)胞組及9 細(xì)胞組，8 細(xì)胞組的囊胚形成顯著高于7 細(xì)胞組和9 細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），7 細(xì)胞組和9 細(xì)胞組的囊胚形成率有一定的差異，但是無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 患者形成囊胚與胚胎具體細(xì)胞數(shù)目的關(guān)系

3.討論

眾所周知，胚胎的質(zhì)量是影響臨床結(jié)局的重要因素。然而在實(shí)際的在體外受精-胚胎移植治療不孕患者的過程中，有很多病人由于第三天沒有優(yōu)質(zhì)胚胎或可用胚胎而放棄移植。根據(jù)現(xiàn)有的發(fā)表文獻(xiàn)來看，新鮮低質(zhì)量胚胎的植入潛力到底如何至今尚無定論[5-6]。一些學(xué)者提出卵裂階段的胚胎質(zhì)量與其植入潛力相關(guān)，而另一些學(xué)者則表示形態(tài)學(xué)參數(shù)較差并不妨礙移植的成功[7]。低質(zhì)量的卵裂期胚胎是否值得冷凍的問題同樣繼續(xù)存在著類似的爭議。

此外，目前在輔助生殖治療的過程中有很多被評為IV 級的胚胎被放棄。研究表明，僅有31.2%胚胎被利用[8]。如果將這些評分低的胚胎進(jìn)行加以利用，那么胚胎的利用率和累計妊娠率將會得到提高。同時研究表明將IV 級胚胎繼續(xù)培養(yǎng)最終可以形成囊胚[9]，囊胚是胚胎體外培養(yǎng)的終末階段，也是很重要的環(huán)節(jié)。除此之外，研究表明與移植胚胎相比，囊胚移植可以提高胚胎種植率和臨床妊娠率[10]。我們研究了本中心826 名患者共8209枚被丟棄的胚胎，將其繼續(xù)培養(yǎng)至D5/D6 天，結(jié)果共形成1371個囊胚，總囊胚形成率為16.7%，總可用囊胚形成率為14.83%，總優(yōu)質(zhì)囊胚形成率為11.57%。因此將一些評分低的胚胎、非正常受精的胚胎（1PN 和0PN）繼續(xù)培養(yǎng)，可以最大限度地利用胚胎，提高囊胚的冷凍和移植數(shù)目，減少患者的損失。

年齡可能是影響囊胚形成的主要因素[11]。我們本次研究單因素分析發(fā)現(xiàn)各年齡組（＜30 歲、30 ～34 歲及＞34 歲）總囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，中等質(zhì)量囊胚形成率和棄去囊胚率有一定的差異，但是無統(tǒng)計學(xué)意義。可能與我們收集的胚胎的質(zhì)量有著很大的關(guān)系，我們主要是研究第三天被丟棄的胚胎的成囊率的情況，這一結(jié)果也說明了年齡可能不是影響廢棄胚胎成囊率的主要因素；其次還可能與我們收集的樣本數(shù)目有一定的關(guān)系，＞34 歲組患者的胚胎數(shù)目較少造成了一定的偏奇。

目前對于胚胎的評級大部分仍然使用胚胎形態(tài)學(xué)評分系統(tǒng)，其中細(xì)胞數(shù)目作為一個重要的參數(shù)指標(biāo)。正常的胚胎發(fā)育為第1 天2 細(xì)胞，第2 天4 細(xì)胞，第三天8 細(xì)胞。然而在實(shí)際胚胎發(fā)育的過程中并不是每個胚胎都能進(jìn)行正常發(fā)育，因此，我們本次將廢棄的胚胎按細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行分組（細(xì)胞數(shù)＜7、7 ～9 細(xì)胞及＞9 細(xì)胞組）。結(jié)果表明7 ～9 細(xì)胞和＞9 細(xì)胞組的囊胚形成率明顯高于細(xì)胞數(shù)＜7，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；7 ～9 細(xì)胞組比＞9 細(xì)胞組的囊胚形成率高，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示我們在選擇移植第三天的胚胎時優(yōu)先考慮接近8 細(xì)胞的胚胎，其次選擇＞9 細(xì)胞的胚胎。此外，按照胚胎正常的發(fā)育情況，第三天理想的細(xì)胞數(shù)目是8 細(xì)胞，而7 和9 細(xì)胞最為接近。那么在沒有8 細(xì)胞的情況下優(yōu)先選擇7 細(xì)胞還是9 細(xì)胞進(jìn)行移植仍然有一定的爭議。因此我們研究了廢棄胚胎7 細(xì)胞、8 細(xì)胞以及9 細(xì)胞的成囊率，結(jié)果表明8 細(xì)胞組的囊胚形成顯著高于7細(xì)胞組和9 細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，7 細(xì)胞組和9 細(xì)胞組的囊胚形成率有一定的差異，但是無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示我們在囊胚形成過程中7 細(xì)胞和9 細(xì)胞并無大的差異，在移植第三天胚胎時針對同等級的7 細(xì)胞和9 細(xì)胞可能并無大的差異。

綜上所述將患者第三天評分低的胚胎進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，可以增加囊胚的冷凍和移植數(shù)目。在第三天同等級的胚胎中，可優(yōu)先選擇接近8 細(xì)胞胚胎進(jìn)行移植，其次是＞9 細(xì)胞的胚胎。同時將評分低的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期，不僅能夠改善低質(zhì)量卵裂胚全部被遺棄的現(xiàn)狀，同時也為無可用胚胎和卵裂胚移植失敗的患者提供第二次臨床妊娠的機(jī)會，降低重復(fù)治療周期的數(shù)目，這在臨床上具有一定的意義。