金星文

摘 要 為研究不同萃取劑萃取馬齒莧有效成分以及不同濃度馬齒莧提取物對大腸桿菌的體外抑菌作用，采用水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、馬齒莧余下水層6種不同的提取溶劑，分別對馬齒莧的有效成分進行提取，并濃縮提取液，過濾藥液，采用紙片法觀察馬齒莧提取物對大腸桿菌的抑菌作用。結果表明：不同溶劑的提取液均有抑菌效果，其中馬齒莧乙醇提取物的抑菌效果最好，抑菌環(huán)可達10.93 mm;水提取物的抑菌效果次之，抑菌環(huán)可達9.53 mm。不同濃度乙醇提取液水溶劑提取液中，以50%的乙醇提取液的抑菌效果最好，抑菌環(huán)可達12.33 mm。馬齒莧乙醇提取物與抗菌藥的聯(lián)合作用中，以馬齒莧乙醇提取物與頭孢噻呋、痢菌凈的聯(lián)合抑菌效果最好。

關鍵詞 馬齒莧;提取物;大腸桿菌;體外抑菌作用

中圖分類號：S853.7 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.15.076

馬齒莧被人們譽為“天然抗生素”，因為其具有廣泛的抗菌作用，對多種細菌和真菌具有一定的抑制性。同時，馬齒莧還是食藥兩用的植物，在我國南北各地都有生長，而且歷史悠久。據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明，馬齒莧具有抗菌殺蟲、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、止痢、降血糖、降血脂等藥理作用，其提取物對大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌都有較好的抑制作用。

化學分析表明，馬齒莧的化學成分比較復雜，其中主要成分有黃酮類、有機酸類、生物堿類、萜類和香豆素類等，其中黃酮類成分的抑菌效果最為明顯。因此，探究馬齒莧對大腸桿菌的體外抑菌作用，為馬齒莧的抑菌研究提供數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 馬齒莧提取液的制備

將采摘回來的馬齒莧洗凈，烘箱60 ℃條件下烘干，再用粉碎機粉碎成粗粉。

1.1.1 馬齒莧水提取液制備

稱取50 g的馬齒莧粗粉，加適量蒸餾水浸泡24 h后，加熱煮沸1 h，過濾藥液，重復煎煮3次，然后將濾液合并在一起，濃縮至50 mL，最后得到濃度為1 g·mL-1的濃縮藥液。將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.1.2 馬齒莧乙醇提取液制備

稱取50 g的馬齒莧粗粉，加入95%的乙醇溶液2 L，混合均勻后，放置在70 ℃條件下，用超聲波震蕩1 h，過濾藥液，重復操作3次，再將藥液減壓蒸餾，濃縮成干粉，用10%二甲基亞砜溶液溶解，得到1 g·mL-1的藥液。將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.1.3 馬齒莧石油醚提取液制備

稱取200 g的馬齒莧粗粉，加入70%的乙醇溶液2 L，放置在70 ℃條件下，回流提取藥液，然后過濾藥液，重復操作3次，將藥液減壓蒸餾，濃縮成浸膏狀，加200 mL去離子水復溶，然后加入200 mL石油醚，進行萃取。分層后取上層石油醚液，下層也繼續(xù)加入200 mL石油醚萃取，直至石油醚層顏色變?yōu)橥该?。合并多次收集的萃取液，減壓蒸餾，濃縮至膏狀，用10%二甲基亞砜溶液溶解，得到1 g·mL-1濃度的藥液，將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.1.4 馬齒莧乙酸乙酯提取液制備

用乙酸乙酯對1.1.3中石油醚萃取完成后的水層進行多次萃取，合并萃取液，經(jīng)減壓蒸餾，得到乙酸乙酯的提取物干粉，用200 mL蒸餾水溶解，得到1 g·mL-1濃度的藥液，將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.1.5 馬齒莧正丁醇提取液制備

用正丁醇對1.1.4中乙酸乙酯萃取完成后的水層進行多次萃取，直至正丁醇層變成無色。合并萃取液，經(jīng)減壓蒸餾，得到正丁醇的提取物干粉，用10%二甲基亞砜溶液溶解，得到1 g·mL-1濃度的藥液，將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.1.6 馬齒莧余下水層提取液制備

余下水層經(jīng)濃縮干燥，用200 mL蒸餾水溶解，得到1 g·mL-1濃度的藥液，將其滅菌后，密封，4 ℃冷藏備用。

1.2 含藥濾紙片的制備

將藥液使用Millex-Cp（孔徑為0.22 μm）的過濾器過濾，用移液槍吸取等量的6種不同溶劑的提取液，慢慢滴在已經(jīng)滅菌后的濾紙片上，晾干，制成6不同的含藥濾紙片。

1.3 大腸桿菌菌液制備

取保存于冰箱中的大腸桿菌菌種，用平板畫線法將其接種在固體培養(yǎng)基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl?5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，調pH達7.6，121 ℃高壓滅菌30 min備用）上，培養(yǎng)24 h，挑選單菌落，接種在斜面培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，按2∶10的比例與水混合后以80 ℃水溫加熱煮30 min，加蔗糖15～20 g，瓊脂20～30 g，蒸餾水定容1 000 mL，自然pH值，121 ℃高壓滅菌30 min備用）中，在37 ℃的溫度下培養(yǎng)24 h。取之前配好的液體培養(yǎng)基10 mL，洗脫斜面上的細菌，得到菌液。將菌液按10倍依次稀釋成3個濃度，用移液槍分別從每個濃度中吸取0.1 mL，涂布在對應的培養(yǎng)基上，分別涂布三次，靜置24 h，然后進行平板菌落計數(shù)，三者取平均值，算出菌液濃度。用培養(yǎng)基將菌液稀釋成（1×106）CFU·mL-1。

1.4 平板的制備

吸取1.3中的大腸桿菌菌液1 mL移入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管，制成25 ug·mL-1菌懸液10 mL，吸取0.2 mL的菌懸液放入90 mm的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中倒入15 mL的營養(yǎng)瓊脂（45 ℃），使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。將制備好的含藥濾紙片放置在培養(yǎng)皿中心，在35 ℃下培養(yǎng)24 h。做三次平行實驗，同時以不含藥液濾紙片的培養(yǎng)皿作為對照組，使用十字交叉法，測量抑菌環(huán)直徑。

1.5 不同濃度的馬齒莧乙醇提取物抑菌試驗

將直徑為6 mm的圓片放入干凈的培養(yǎng)皿內，高壓蒸汽滅菌，分別浸入馬齒莧水提取液和不同濃度的馬齒莧乙醇提取物中，其中馬齒莧的乙醇提取液濃度分別為30%、50%、70%和95%，分別進行抑菌實驗。

1.6 馬齒莧乙醇提取物與抗菌藥的聯(lián)合作用試驗

為探究馬齒莧乙醇提取物聯(lián)合抗菌藥對大腸桿菌菌株有無抑菌作用，對大腸桿菌菌株進行傳代培養(yǎng)，分別添加馬齒莧乙醇提取物和11種常見的獸用抗菌藥，根據(jù)最小抑菌濃度的變化情況，對比聯(lián)合使用和單獨使用的抑菌情況。將亞抑菌濃度的馬齒莧乙醇提取物添加到濃度為106 CFU·mL-1的菌懸液中，在96孔板的每個小孔中加入100 ?L稀釋菌液，在第一列中每孔加入不同抗菌藥，使抗菌藥最終濃度為2 MIC，中藥濃度為0.5 MIC，之后倍比稀釋至第11孔，設置兩個小孔為中藥對照孔。將反應板放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，此為中藥與抗菌藥聯(lián)合作用第一代。第二代與第一代方法相同，只需取第一代孔板的菌液5 ?L轉移至第二代96孔板中。按以上方法培養(yǎng)3代，察記錄各代的聯(lián)合最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 不同種類馬齒莧提取物對大腸桿菌的抑菌效果

馬齒莧不同提取物的抑菌效果見表1。根據(jù)表可知，抑菌效果最好的是乙醇提取物，抑菌環(huán)直徑平均值達到了10.930 mm，與其他種類提取物有極顯著性差異。其次是馬齒莧水提物，抑菌環(huán)直徑平均值達到了9.530 mm，而正丁醇提取物的抑菌環(huán)直徑平均值為9.467 mm，兩種溶劑效果相差不大。乙酸乙酯提取物略差，抑菌環(huán)直徑平均值為3.160 mm;效果最差的是石油醚提取物，其抑菌環(huán)直徑平均值只有1.230 mm。

2.2 不同濃度乙醇提取液對大腸桿菌的體外抑菌效果

乙醇提取液的抑菌效果最好，水提取液次之，因此探究這兩種液體的混合提取液的抑菌效果，見表2。由表可知，50%乙醇提取液對大腸桿菌的體外抑菌作用優(yōu)于其他4組，抑菌環(huán)直徑平均值達到了12.33 mm。30%乙醇提取液和70%乙醇提取液的體外抑菌效果相近，抑菌環(huán)直徑平均值分別為11.56 mm和11.83 mm。由此推測，乙醇和水的混合溶劑比其他單一溶劑的馬齒莧提取物提取液對大腸桿菌的抑菌效果好。

2.3 馬齒莧乙醇提取物與抗菌藥的聯(lián)合作用

觀察表3的抑菌效果MIC值可以看出，馬齒莧乙醇提取物與頭孢噻呋、痢菌凈的聯(lián)合抗菌作用比較好。與頭孢曲松、頭孢噻肟、氟苯尼考的聯(lián)合抗菌作用有一些效果，與阿米卡星聯(lián)用沒有明顯變化，說明互不影響。但與環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、克林沙星、林可霉素聯(lián)用時，MIC值上升，說明這幾種抗菌藥與馬齒莧乙醇提取物會互相抵消。

3 討論與結論

不同溶劑的提取液均有抑菌效果，其中馬齒莧乙醇提取物的抑菌效果最好，抑菌環(huán)可達10.930 mm;水提取物的抑菌效果次之，抑菌環(huán)可達9.530 mm。不同濃度乙醇提取液中，以50%乙醇提取液的抑菌效果最好，抑菌環(huán)可達12.33 mm。馬齒莧乙醇提取物與抗菌藥的聯(lián)合作用中，以馬齒莧乙醇提取物與頭孢噻呋、痢菌凈的聯(lián)合抑菌效果最好。

（責任編輯：趙中正）