甄麗影

對乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol, paracetamol, APAP)是一種非甾體類消炎藥。使用高劑量APAP時(shí)，其代謝物可引起肝毒性[1]。此外，在美國已有報(bào)道稱，過量使用APAP導(dǎo)致急性肝衰竭[2]。長期以來，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)被用作檢測藥物性肝損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而據(jù)報(bào)道，ALT在糖尿病[3]、心肌梗死[4]等情況下同樣會(huì)升高，缺乏特異性。因此，我們迫切需要尋找合適的生物標(biāo)志物預(yù)測APAP所致急性肝損傷的早期不良反應(yīng)。

泛酰巰基乙胺酶(Vanin-1)是一種上皮細(xì)胞糖基化磷脂酰肌醇錨定的水解酶，在肝臟、腸道和腎臟中高表達(dá)[5]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，尿液Vanin-1是藥物致急性腎損傷的早期診斷標(biāo)志物，且敏感性較高[6]。在肝臟疾病中，有研究證實(shí)高脂飲食小鼠的Vanin-1 mRNA表達(dá)量增加[7]，另有報(bào)道稱Vanin-1基因可能在安妥明介導(dǎo)的保肝作用中發(fā)揮作用[8]。然而目前尚無關(guān)于APAP誘導(dǎo)急性肝損傷和Vanin-1表達(dá)變化的報(bào)道。本研究旨在建立APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠模型，檢測小鼠血清Vanin-1、ALT表達(dá)變化，分析其相關(guān)性，并進(jìn)一步探討Vanin-1作為APAP致急性肝損傷早期評估標(biāo)志物的可能性。

資料與方法

一、動(dòng)物與試劑

健康SPF級雄性C57BL/6雄性小鼠(8周齡)48只，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為：環(huán)境溫度22±2℃，濕度60%～80%，循環(huán)光照(12h明暗交替)，自由飲水和進(jìn)食，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)操作，處理前禁食20 h。APAP購自東和藥品有限公司(日本)，TRIzol裂解液、BCA蛋白濃度測定液購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(美國)，PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit及SYBR Premix Ex Taq購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(日本)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海生物化工有限公司代為設(shè)計(jì)生產(chǎn)，Vanin-1 ELISA試劑盒購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(英國)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)小鼠急性肝損傷模型的制備 小鼠隨機(jī)分為4組(每組n=32)：對照(Control)組、100 mg/kg APAP處理組、200 mg/kg APAP處理組、300 mg/kg APAP處理組。APAP處理組小鼠經(jīng)腹腔注射給藥，對照組相同方式給予0.9%生理鹽水。分別在APAP處理后0、4、8、12、16、24、36、48 h時(shí)處理經(jīng)尾靜脈采血(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=4)，5 000 g 25 ℃離心10 min，收集血清檢測ALT及Vanin-1 mRNA，處死小鼠留取肝臟組織供酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測Vanin-1蛋白表達(dá)。

(二)qRT-PCR測血清 Vanin-1 mRNA表達(dá)變化 TRIzol法提取血清Vanin-1 mRNA，260 nm波長下測得mRNA濃度，根據(jù)試劑說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green擴(kuò)增目的基因，β-acti作為內(nèi)參基因，計(jì)算Vanin-1 mRNA的相對表達(dá)變化，引物序列如下：Vanin-1 Forward(5′-3′) AAC-TGGATACCCTGTGATAACCC，Reverse(5′-3′) GTCTCCCATGTTCGCCACAA；β-actin Forward (5′-3′) GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，Reverse(5′-3′) GCCGGACTCATCGTACTCC。

(三)ELISA法測肝組織Vanin-1蛋白表達(dá)變化 裂解小鼠肝臟組織獲得蛋白樣本，使用BCA蛋白檢測試劑盒定量蛋白濃度，每孔加入25 μg 蛋白進(jìn)行ELISA測定。

結(jié) 果

一、APAP急性肝損傷模型建立

給予小鼠腹腔注射不同濃度APAP(100、200、300 mg/kg)，并在12 h檢測血清ALT及Vanin-1 mRNA水平。如表1所示，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，100 mg/kg APAP給藥濃度引起ALT(P<0.001)及Vanin-1 mRNA(P<0.001)水平不同程度增加，200 mg/kg時(shí)兩者水平較100 mg/kg持續(xù)升高(P<0.05)，并達(dá)到平臺(tái)期，200 mg/kg與300 mg/kg的給藥濃度引起的ALT及Vanin-1 mRNA上調(diào)水平無差異(P>0.05)。此外，如圖1所示，Pearson相關(guān)系數(shù)示ALT與Vanin-1 mRNA表達(dá)水平具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R為0.918(P<0.001)。

表1 四組小鼠APAP處理12 h后的ALT及Vanin-1 mRNA水平 (±SD)

圖1 Pearson相關(guān)系數(shù)評價(jià)ALT活性與Vanin-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

二、300 mg/kg APAP處理下，小鼠血清ALT及Vanin-1 mRNA表達(dá)水平變化

如圖2所示，分別在給藥300 mg/kg APAP后0、4、8、12、16、24、36、48 h測定血清ALT活性和Vanin-1 mRNA表達(dá)。發(fā)現(xiàn)給藥后8 h ALT活性升高，16 h時(shí)到達(dá)峰值，然后逐漸降低。而Vanin-1則在給藥后4 h開始明顯升高，12 h達(dá)到峰值，并在48 h前迅速下降至峰值的50%。與ALT活性相比，Vanin-1的表達(dá)差異較大。

圖2 給藥300 mg/kg APAP后不同時(shí)間點(diǎn)的ALT活性(A)和Vanin-1 mRNA(B)表達(dá)變化

三、小鼠肝臟Vanin-1蛋白表達(dá)變化

如圖3所示，300 mg/kg APAP處理?xiàng)l件下，小鼠肝臟Vanin-1蛋白表達(dá)水平在4 h時(shí)增高，8 h時(shí)到達(dá)峰值，隨后逐漸下降。肝臟Vanin-1蛋白表達(dá)與血清表達(dá)變化規(guī)律一致，但到達(dá)高峰時(shí)間早于血清。

圖3 小鼠肝組織Vanin-1表達(dá)水平變化(ng/mg)

討 論

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，APAP處理組小鼠的Vanin-1表達(dá)顯著上調(diào)，且表達(dá)變化早于ALT，提示Vanin-1在監(jiān)測APAP引起的早期急性肝損傷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Vanin-1是調(diào)節(jié)谷胱甘肽(GSH)對上皮細(xì)胞氧化損傷依賴性反應(yīng)的關(guān)鍵分子[9]。Hosohata等通過建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第7天，當(dāng)腎小管組織病理學(xué)損傷明顯時(shí)，腎盂尿中Vanin-1水平明顯高于假手術(shù)組[10]，提示尿Vanin-1可能作為腎小管損傷的潛在生物標(biāo)志物。另外，Heiko Hosohata同樣在藥源性急性腎損傷大鼠模型尿液中檢測到Vanin-1水平升高，且其變化早于其他生物學(xué)標(biāo)志物如NGAL、Kim-1等[6]。目前尚無關(guān)于Vanin-1與APAP致急性肝損傷的研究數(shù)據(jù)，我們給小鼠腹腔注射不同濃度APAP構(gòu)建藥物誘導(dǎo)性急性肝損傷模型，通過檢測血清及蛋白Vanin-1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨造模時(shí)間延長，血清及蛋白Vanin-1表達(dá)均呈先上升后下降趨勢，肝臟下降趨勢早于血清，這可能是由于肝臟代謝較血液更為快速。另外，血清Vanin-1 mRNA在小鼠肝臟發(fā)生急性肝損傷后的表達(dá)變化與ALT呈相關(guān)性，提示我們Vanin-1有作為肝損傷早期標(biāo)志物的潛力，值得注意的是，血清Vanin-1表達(dá)水平變化早于ALT，這意味著Vanin-1比ALT在評估APAP致急性肝損傷中更具敏感性，其中具體機(jī)制和評估效果仍需分別在基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。