虞倩 潘柏申

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)是生物體內(nèi)參與谷氨酰循環(huán)的關鍵酶，具有重要的抗氧化、解毒功能，參與維護膜完整性，影響氨基酸向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)代謝與細胞分化發(fā)育?；诨瘜W速率法的外周血GGT酶活性檢測在肝膽系統(tǒng)疾病中的異常檢出率極高，被廣泛用于疾病提示與監(jiān)測。其診斷靈敏度高，但特異性差，正常結(jié)果可協(xié)助肝病排除診斷，異常則需聯(lián)合其他指標進一步解讀。在實際臨床中，常需就各種原因引起的GGT獨酶升高(又稱GGT血癥)進一步鑒別。

Bibas等[1]于1994年曾報道過一例聚集性GGT血癥家系。17例成員中有7例血清GGT活性顯著升高，分布于3 600 ～ 6 000 U/L(比色法，參考區(qū)間0 ～ 50 U/L)。在當時技術條件下，利用區(qū)帶電泳技術對血清GGT同工酶組分進行鑒定，共分離出4個區(qū)帶，其中位于電泳α1區(qū)帶的“GGT-2”含量增多，是構成血清GGT總活性升高的主要組分[2]。該家系中GGT血癥個體均身體健康且其他相關檢測正常，GGT獨酶升高表征呈常染色體顯性遺傳模式。

一、GGT編碼基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

人GGT(hGGT)為多基因簇，由至少7個基因或假遺傳因子組成。唯一可編碼功能性蛋白的基因座hGGT1位于第22號染色體長臂，序列極為保守。 hGGT1利用不同激活子調(diào)節(jié)其在生理變異及不同病理狀態(tài)下的表達，形成組織及細胞間轉(zhuǎn)錄水平差異。個體血清GGT活性受遺傳和環(huán)境因素雙重影響，生物異源物質(zhì)可刺激hGGT1表達，增強其參與調(diào)控的一系列代謝及去毒反應，保護組織細胞免受氧應激損傷。

二、GGT翻譯調(diào)節(jié)及翻譯后修飾

hGGT1經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后形成無活性多肽鏈前體，經(jīng)自主催化分裂成大、小兩個亞基(351/189 aa)，組成異二聚體蛋白。其中疏水性大亞基含具27個氨基酸殘基的信號肽，形成一跨膜結(jié)構域，利用親脂序列以離子鍵與細胞膜緊密結(jié)合；親水性小亞基則含有酶催化活性中心。

GGT蛋白的一級結(jié)構同樣高度保守，對應其在生物體中所行使的重要生理作用。翻譯后糖基化修飾差異是形成GGT次級同工酶的基礎，大、小亞基上分別含有6個及1個N-糖基化位點。在正常肝細胞中，GGT具有完整的Galβ1→4GlcNAcβ1外型糖鏈；而在病理情況下，胞內(nèi)次級調(diào)節(jié)變化所導致的翻譯后修飾異常令GGT表現(xiàn)出相應的特殊外型糖鏈，例如：糖基誘導酶活化導致分支結(jié)構增多、唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性增加導致唾液酸含量升高。糖鏈天線結(jié)構的差異形成了具有相似理化特性的不同分子形式，可利用電泳遷移率(基于分子大小)、親和層析法(基于凝集素親和力差異)對同工酶組分進行分離鑒定，在疾病鑒別診斷中具有檢測價值。

三、GGT組織及細胞分布

GGT廣泛分布于機體組織器官，具分泌或吸收功能的細胞表面常富含其蛋白，如腎小管細胞基底面等。腎臟及前列腺組織中GGT含量雖最高，但主要經(jīng)尿液排出。肝臟中GGT含量則較低，但卻是血清GGT活性的主要來源。其蛋白在膽管上皮細胞和肝小葉中央?yún)^(qū)域的肝小管和竇間隙部位表達較多，正常情況下經(jīng)肝細胞分泌后隨膽汁排泄。

GGT在細胞中可分為疏水性的膜結(jié)合型和親水性的胞質(zhì)游離型，生理情況下膜結(jié)合型可占據(jù)肝細胞整體酶活性的90%。血清GGT活性病理性升高的機制主要包括合成增加與釋放增加：合成增加由藥物、酗酒、肝細胞再生及惡變所誘導的轉(zhuǎn)錄上調(diào)引起；釋放增加則源于細胞膜損害所造成的蛋白釋放，以及膽汁淤積過程中表面活性膽汁酸發(fā)揮去污作用從而洗脫膜結(jié)合型蛋白。在出現(xiàn)嚴重細胞壞死時，大小不一的膜結(jié)合型GGT-脂蛋白-膜碎片聚合物與胞內(nèi)游離型GGT共同釋放入血，外周血中GGT復合物分子量大小隨之呈現(xiàn)出顯著差異。

采用不同支持介質(zhì)(濾紙、醋纖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠等)的區(qū)帶電泳技術分辨率存在差異，就GGT分離鑒定所獲得的相應條帶數(shù)量不同。目前基于不同技術及技術改良所獲得的分離條帶及組分命名形式繁多，需注意結(jié)合具體技術進行區(qū)分。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳最多可分離11～13個GGT條帶，具有較高的靈敏度，其中GGT-II帶經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有肝癌特異性，在部分研究中診斷陽性率可達90%[3-4]。圍繞GGT各組分含量及活性水平開展有心血管、代謝等疾病關聯(lián)性研究，但因相關檢測技術操作復雜暫未走向臨床應用。不同分子量的GGT復合物成分及其具體結(jié)合形式、產(chǎn)生機制目前也尚無定論[5-6]。

四、遺傳性GGT獨酶升高新機制的發(fā)現(xiàn)

De Grandi等[7]研究上述家系(家系1，來自意大利)及另一具有相似表現(xiàn)的獨立家系(家系2，來自斯洛伐克)發(fā)現(xiàn)兩家系中GGT血癥個體的血漿GGT活性水平分布于2 820 ～ 9 630 U/L(速率法，參考范圍9 ～ 55 U/L)，年齡跨度4 ～ 70歲，提示該表征先天外顯且持續(xù)終生。研究者利用更為靈敏的高效凝膠過濾色譜技術，根據(jù)分子量對GGT組分進行分離，并結(jié)合柱后熒光底物酶促反應檢測不同組分的GGT活性，在兩家系中首次發(fā)現(xiàn)了一種獨特的、可顯著區(qū)分于其他常見肝膽疾病的GGT組分模式(圖1)。GGT血癥個體血液中、小分子量及游離GGT(f-GGT)含量遠超參考上限[8]，且其中f-GGT活性約占GGT總活性的97%。與經(jīng)免疫印跡分析所觀察到的血清GGT蛋白(50～75 kDa)含量顯著增加相對應。

利用高效凝膠過濾色譜技術分離GGT組分，橫軸為洗脫體積。利用柱后熒光底物酶促反應檢測各組分酶活性，左側(cè)縱軸對應酶促反應熒光信號強度，右側(cè)縱軸對應GGT酶活性。圖中實線代表家系研究中[3]的正常對照個體，虛線代表GGT血癥個體?？s寫：b-GGT，大分子量GGT；m-GGT，總分子量GGT；s-GGT，小分子量GGT；f-GGT，游離GGT。

研究進一步通過全基因組測序鑒定發(fā)現(xiàn)：兩家系成員均伴隨GGT血癥攜帶有特定的hGGT1(NM_013421.2)雜合突變，包括家系1所攜帶的錯意突變c.44T>G(p.Leu15Arg)，以及家系2所攜帶的框內(nèi)缺失突變c.28_54del(p.Leu10_Val18del)。兩類突變所影響的編碼序列相重合。研究利用hGGT1 cDNA測序和實時表達分析發(fā)現(xiàn)突變型與野生型等位基因表達量均相當，不影響hGGT1轉(zhuǎn)錄水平。

經(jīng)多種軟件及工具預測，提示兩類突變可影響蛋白質(zhì)結(jié)構，其中框內(nèi)缺失c.28_54del(p.Leu10_Val18del)可導致GGT N基端跨膜結(jié)構域缺失近一半。另通過構建錯意突變c.44T>G(p.Leu15Arg)轉(zhuǎn)染c21細胞發(fā)現(xiàn)：突變細胞分泌釋放大量f-GGT進入培養(yǎng)上清，胞膜附著的GGT蛋白較野生對照幾乎全部消失；而野生型細胞所分泌的b-GGT和f-GGT數(shù)量相當。故推測兩類突變均通過破壞GGT1跨膜結(jié)構域功能，令含有完整活性的酶蛋白不再附著于細胞膜，游離入血。這有效解釋了GGT血癥的成因，為我們打開了解釋GGT獨酶升高的新視角。

過去唯一被報道的其他致病性hGGT1突變僅由16.9 kb大片段純合缺失(16.9-KB DEL/13-BP INS，RCV000656520)所致的GGT酶活性完全缺失(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶缺乏癥，谷胱甘肽尿癥，OMIM 231950)[10]。兩家系GGT血癥個體均攜帶雜合子突變，可能因此未呈現(xiàn)出顯著的GGT調(diào)節(jié)功能異常。

研究提示持續(xù)的高水平血漿GGT活性未就個體內(nèi)GGT底物水平產(chǎn)生影響(觀察了全血及尿液中的谷胱甘肽、氨基酸、LTE-4，血漿氨基酸、胱氨酸基白三烯水平)，故由c.44T>G(p.Leu15Arg)及c.28_54del(p.Leu10_Val18del)雜合突變所引起的GGT血癥可評價為良性病癥。對于具有家族遺傳表現(xiàn)的GGT獨酶活性增高患者，檢測該兩類突變或可幫助揭示病因，避免其接受重復及侵入性診斷檢查。