任夢(mèng)，趙曉婷，岳文濤

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100026

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)疾病中最致命的惡性腫瘤，在所有女性惡性腫瘤中其死亡率排名第五[1]。當(dāng)前，卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是手術(shù)聯(lián)合化療，但仍有70%的卵巢癌患者最終復(fù)發(fā)并伴有嚴(yán)重的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此，深入研究卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制極其重要。NUF2基因在細(xì)胞有絲分裂過程中通過調(diào)節(jié)著絲粒與紡錘體微管的結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[3]。研究表明，NUF2異常表達(dá)于乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌和口腔癌等多種惡性腫瘤中，與腫瘤進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-10]。但NUF2在卵巢癌中的研究較少，尤其是在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移方面未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探討NUF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響及其分子作用機(jī)制，以期為卵巢癌的治療提供新的突破點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌CAOV3、HEY和SKOV3細(xì)胞購(gòu)于國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)，人正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC為復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院徐從劍教授饋贈(zèng)；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640、青霉素和鏈霉素購(gòu)于Gibco公司；無義siRNA（control siRNA）和NUF2 siRNA購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司；RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；NUF2和GAPDH引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京全式金生物有限公司；NUF2、GAPDH抗體購(gòu)于Abcam公司；Notch1、Hes1抗體購(gòu)于Cell Signal?ing Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)于北京誼誠(chéng)盛盈生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HOSEpiC、CAOV3、HEY、SKOV3細(xì)胞系用添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染及分組

廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)了3種NUF2-靶標(biāo)特異性siRNA（si-NUF2）用于下調(diào)NUF2的表達(dá)，分別為siRNA1（5'-GGAGAGACUU GAUUCUGUUTT-3'）、siRNA2（5'-GCCUUCAUGU CAGUUGGAATT-3'）和 siRNA3（5'-GGACCAAAU UGAGAGUGAUTT-3'），control siRNA（si-control）序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCAGGUTTUCCAG GTCUAGTT-3'。在6孔板上以2×105/孔接種HEY、SKOV3細(xì)胞，用LipofectAMINE RNAiMAX將si-control和si-NUF2分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分為si-control組和si-NUF2組，未做任何處理細(xì)胞為空白對(duì)照組（control組）。轉(zhuǎn)染48 h后，通過qRTPCR和Western印跡驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用TRIzol試劑提取細(xì)胞RNA，NanoDrop1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，采用SYBR Premix EX Taq，ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，GAPDH為內(nèi)參，NUF2 mRNA的表達(dá)水平通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。NUF2 上游引物為 5'-ACAAGTC GGTTTTTAAGTGGCA-3'，下游引物為5'-GCATT TTGTCCGCAGAGGATTT-3'；GAPDH 上游引物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 蛋白印跡法

收集各組處理后的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳畢，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜與一抗NUF2（1∶500）、Notch1（1∶500）、Hes1（1∶500）和 GAPDH（1∶1000）置于4℃孵育過夜。TBST洗滌膜之后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶7500）室溫孵育2 h。通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。

1.6 細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell小室用于細(xì)胞侵襲遷移能力測(cè)定。對(duì)于細(xì)胞侵襲能力測(cè)定，用0.2% BSA稀釋基質(zhì)膠（1∶4）后，取 50 μL 鋪于 Transwell小室上室，37℃孵育1 h，將1.2×105細(xì)胞接種到含100 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的Transwell小室上室中，下室加入含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用0.1%的結(jié)晶紫染液對(duì)小室下表面細(xì)胞進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝5個(gè)視野的細(xì)胞圖片，用Image J圖像軟件計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。對(duì)于細(xì)胞遷移能力測(cè)定，將2×104細(xì)胞接種到無基質(zhì)膠的Transwell小室上室，其他步驟與Transwell小室侵襲測(cè)定相同。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板，用control siRNA或si-NUF2轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用100 μL槍頭在細(xì)胞層垂直劃痕。加入PBS清除劃痕后脫落的細(xì)胞，將培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基，用Image J圖像軟件量化各組細(xì)胞劃痕間隙距離，之后每24 h拍照，監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移情況，測(cè)量劃痕間的距離，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。細(xì)胞劃痕愈合率=［劃痕間隙距離（24、48、72 h）-劃痕間隙距離（0 h）］/劃痕間隙距離（0 h）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 NUF2在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)

為了探討NUF2在卵巢癌中的表達(dá)，我們從GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得426個(gè)卵巢癌組織和88個(gè)癌旁組織中NUF2的表達(dá)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1A，卵巢癌組織中NUF2的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，通過qRTPCR檢測(cè)了NUF2在人卵巢癌細(xì)胞系（CAOV3、HEY、SKOV3）和人正常卵巢上皮細(xì)胞（HOSEpiC）中的表達(dá)，結(jié)果如圖1B，與HOSEpiC細(xì)胞相比，人卵巢癌細(xì)胞系CAOV3、SKOV3和HEY中NUF2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些數(shù)據(jù)表明，NUF2在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)增加。

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞中NUF2的表達(dá)

為了探討NUF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響，用siRNA沉默SKOV3、HEY細(xì)胞中NUF2的表達(dá)，結(jié)果見圖2，轉(zhuǎn)染48 h后，HEY、SKOV3細(xì)胞中NUF2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于si-con?trol組和 control組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明si-NUF2能夠顯著沉默NUF2的表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室侵襲遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HEY細(xì)胞中（圖3A），si-NUF2轉(zhuǎn)染組穿過有基質(zhì)膠小室的細(xì)胞數(shù)為50.20±6.31，較si-control組（121.40±9.85）和 control組（131.40±9.85）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；穿過無基質(zhì)膠小室的細(xì)胞數(shù)為60.20±5.31，較si-control組（110.40±4.85）和 control組（111.40±6.85）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在SKOV3細(xì)胞中可得到類似結(jié)果（圖3B）。這就提示抑制NUF2表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

圖1 NUF2在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

圖2 qRT-PCR檢測(cè)si-NUF2對(duì)NUF2 mRNA表達(dá)水平的影響

HEY細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A，與si-control組和control組比較，轉(zhuǎn)染si-NUF2組的細(xì)胞遷移能力顯著降低，其劃痕愈合率為si-control組的0.47±0.04倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SKOV3細(xì)胞中得到類似結(jié)果（圖4B）。

2.5 沉默NUF2表達(dá)抑制Notch信號(hào)通路

圖3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NUF2沉默對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NUF2沉默對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

Notch信號(hào)通路與腫瘤侵襲遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，為了探究NUF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響機(jī)制，通過GEPIA對(duì)NUF2和Notch信號(hào)通路相關(guān)分子間的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，如圖5A所示，NUF2與Notch1、Hes1間表達(dá)呈正相關(guān)的關(guān)系。采用Western印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證抑制NUF2表達(dá)后，Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果見圖5B，沉默NUF2表達(dá)后，Notch1和Hes1蛋白表達(dá)水平與si-control組和control組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上實(shí)驗(yàn)說明NUF2通過異常激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移。

3 討論

卵巢癌患者低生存率和不良預(yù)后的主要原因是由于卵巢癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移。因此，深入探索卵巢癌侵襲和遷移機(jī)制是當(dāng)前卵巢癌臨床研究的熱點(diǎn)。

細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族是維持正常細(xì)胞功能所必需的，其異常表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[11]。NUF2作為細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族中的重要成員，在細(xì)胞有絲分裂過程中對(duì)于動(dòng)粒-微管的正確附著和染色體的正常分離起重要作用，而染色體的錯(cuò)誤分離會(huì)導(dǎo)致基因不穩(wěn)定性，最終誘發(fā)腫瘤[12]。郭云韜等[13]利用siRNA干擾技術(shù)抑制人肝癌HCCLM3細(xì)胞中NUF2的表達(dá)，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降。Wong等[14]發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中circFOKX2、YBX1和hnRNPK相互作用能夠增強(qiáng)NUF2和PDXK的表達(dá)，敲低circFOXK2引起NUF2表達(dá)降低，癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力受到抑制。為了進(jìn)一步研究NUF2在卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移中的作用，本研究首先驗(yàn)證了卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中NUF2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織及正常卵巢上皮細(xì)胞相比，NUF2在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯升高。通過NUF2 siRNA干擾卵巢癌HEY、SKOV3細(xì)胞中NUF2的表達(dá)后，Tran?swell小室侵襲遷移實(shí)驗(yàn)顯示si-NUF2組穿過小室的細(xì)胞數(shù)顯著少于si-control組和control組，表明沉默NUF2可抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示si-NUF2組細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于si-control組和control組。這就表明NUF2在卵巢癌中的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移密切相關(guān)。

研究證實(shí)Notch信號(hào)通路廣泛存在于不同物種中，是一個(gè)高度保守的信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等行為。Notch信號(hào)通路在卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中呈異常激活狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[15-16]。Notch信號(hào)通路的經(jīng)典激活方式是Notch配體結(jié)合Notch受體，使受體水解釋放Notch胞內(nèi)域，Notch胞內(nèi)域進(jìn)入細(xì)胞核作用于靶基因（如HES1、HES3 和 HES5），誘發(fā)相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)[17]。Notch1是Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，Hes1是Notch信號(hào)通路的下游基因。Liu等[18]的研究表明，在小細(xì)胞食管癌中，NUF2與Notch信號(hào)通路密切相關(guān)，可能參與腫瘤的進(jìn)展。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)NUF2與Notch信號(hào)通路相關(guān)分子間表達(dá)呈正相關(guān)，Western印跡檢測(cè)顯示沉默NUF2表達(dá)后，與control組和si-control組相比，si-NUF2組Notch1、Hes1的表達(dá)明顯降低，表明抑制NUF2表達(dá)后能夠抑制卵巢癌細(xì)胞Notch通路的激活，從而降低癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。

圖5 Western印跡檢測(cè)NUF2沉默對(duì)Notch通路相關(guān)分子的影響

綜上所述，沉默NUF2表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移，其機(jī)制可能與下調(diào)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這就提示NUF2能夠參與卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移過程，為卵巢癌的治療提供了新方向。但是NUF2如何與靶蛋白相互作用從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，仍須進(jìn)一步探索。