彭偉文，陸陽存，戴衛(wèi)波

(中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400)

琴葉榕為桑科榕屬植物琴葉榕FicuspandurataHance[1]。參考前期的初步實驗結(jié)果及相關文獻可知，其生藥中含有0.32%的包括槲皮素及蘆丁等黃酮類成分[2]。在體外抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)，2 mg/mL總提取物浸膏溶液的氧活性清除率達76.64%，其同質(zhì)量濃度下的總黃酮粗制品溶液的清除率與0.2 mg/mL的VC對照品溶液接近，且均大于90%。目前琴葉榕總黃酮的純化工藝鮮有報道，本實驗通過結(jié)合靜態(tài)及動態(tài)的吸附-解吸試驗，以極性分類，選取廣泛應用于純化總黃酮的D-101型、AB-8型和NKA-9型的3種大孔樹脂作為考察對象，綜合考慮單因素試驗及多因素的正交試驗而進一步配置出用于精制琴葉榕總黃酮的相關工藝參數(shù)，為琴葉榕下一步的深入研究提供基礎和參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材和試劑

琴葉榕自采于江門市臺山市三合鎮(zhèn)玉懷鳳塘村，由華南植物研究所葉華谷研究員鑒定為桑科榕屬植物琴葉榕FicuspandurataHance。無水乙醇(AR級)，購于西隴科學股份有限公司；蘆丁(批號：100080-201610)，購于中國食品藥品檢定研究院；D-101，AB-8，NKA-9型大孔樹脂，購于廣州東銳科技有限公司；水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

DGG9123AD型自動程控烘箱，杭州單馳儀器有限公司；JJ200型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；HS-4型水浴鍋，大倉市華利達實驗設備有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；H1850R型醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；CCA-1112A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA公司；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱，廣州東方電熱干燥設備廠；BS224型電子天平，Sartorius公司；UV-2550型分光光度計，島津公司；單標移液管；0-100量程的酒精計。

2 方法與結(jié)果

2.1 琴葉榕總提物的制備

準確稱取琴葉榕粗粉2 000 g，以6倍量的50%的乙醇作提取溶劑，超聲破壁30 min后，95 ℃水浴回流提取3次，2 h/次，合并提取液，5 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過濾，得濾液。55 ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至濾液無醇味(總黃酮7.58 mg/mL)，從中量取部分溶液稀釋至250 mL(總黃酮2.64 mg/mL)，并制備總黃酮濃度分別為6.064 mg/mL、4.548 mg/mL、3.638 mg/mL、1.455 mg/mL、0.758 mg/mL的梯度上樣液各50 mL，剩余濃縮液低溫密封保存，備用。

2.2 標準曲線

精密制備101 μg/mL、226 μg/mL及860 μg/mL的蘆丁標準品溶液，參考文獻[3]，分別精密量取0、1、2、3、4、5、6 mL溶液置于25 mL的容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，依次間隔6 min再加入1 mL的5%NaNO3溶液、1 mL的10%AlNO3溶液及10 mL的NaOH溶液(1 mol/L)，蒸餾水定容至刻度，反應16 min。于510 nm處測定各自的吸光度(A值)，以A值對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，分別得方程A1=0.011C1-0.004(R12=0.995)，線性范圍4.04～24.24 μg/mL；A2=0.011C2+0.001(R22=0.998)，線性范圍9.04～54.24 μg/mL；A3=0.011C3+0.008(R32=0.997)，線性范圍34.4～206.4 μg/mL。

2.3 樹脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附-解吸性能比較 取預處理好的D-101、AB-8、NKA-9型濕樹脂均2.0 g置于3個100 mL的具塞錐形瓶中，加入總黃酮質(zhì)量濃度為2.64 mg/mL的上樣液20 mL，靜態(tài)吸附10 h，過濾；濾渣以20 mL蒸餾水淋洗，抽干。量取60 mL的50%乙醇靜置洗脫10 h。見表1。

吸附量=(C0V0-C1V1)/m；解吸率=C2V2/(C0V0-C1V1)

C0=2.64 mg/mL；C1—濾液中總黃酮濃度；V0=20 mL；V1—濾液的體積；m=2.0 g；C2—解吸液中總黃酮濃度；V2—解吸液體積

2.3.2 動態(tài)吸附-解吸性能比較 取預處理好的3種樹脂各10.0 g，濕法裝柱，貼壁緩慢加入20 mL的上樣液，以2 BV/h的體積流量進行過柱，過柱液重吸附2次，再加入適量的蒸餾水以相同的體積流量清洗樹脂，洗液并入過柱液中；將這些柱子中的樹脂，均以200 mL的50%乙醇作為洗脫劑，體積流量為2 BV/h，收集洗脫液。見表1。

表1 3種大孔樹脂的靜態(tài)及動態(tài)吸附-洗脫性能

吸附容量=(C0V0-C3V3)/m2；動態(tài)解吸率=C4V4/(C0V0-C3V3)

C3—過柱液中總黃酮質(zhì)量濃度；V3—過柱液體積；m2=10.0 g；C4—動態(tài)解吸質(zhì)量濃度；V4—動態(tài)解吸液體積

2.4 AB-8型樹脂精制總黃酮的工藝

2.4.1 最佳上樣濃度考察 取濕重均為3.0 g的AB-8型號大孔樹脂經(jīng)預處理好后，分別置于5個具塞錐形瓶中，依次加入“2.1”中的梯度上樣液，靜置4 h，過濾，測濾液總黃酮濃度；濾渣均以50%乙醇20 mL靜態(tài)洗脫4 h，測洗脫液中總黃酮濃度。結(jié)果如圖1及表2所示，結(jié)合圖表可知，最佳上樣濃度為1.455 mg/mL。

圖1 最佳上樣濃度曲線

表2 不同上樣濃度的靜態(tài)解吸考察

2.4.2 最佳吸附時間考察 分別稱取5份3.0 g預處理好的AB-8濕樹脂置于具塞錐形瓶中，加入總黃酮質(zhì)量濃度為1.455 mg/mL的上樣液10 mL，靜態(tài)考察后，參照前述方法測定并計算總黃酮的吸附率、解吸率、純度。結(jié)果如圖2所示，確定最佳靜態(tài)吸附時間為4 h。

2.4.3 洗脫劑考察 分別取3 g濕樹脂置于5個具塞錐形瓶中，加入1.455 mg/mL的上樣液10 mL，編號為40%、50%、60%、70%、80%，靜態(tài)吸附4 h后，過濾，濾渣以相應的乙醇洗脫4 h，見表3，故宜選70%的乙醇作為最佳洗脫劑。

表3 不同濃度乙醇的洗脫性能

注：A：吸附時間—吸附率；B：吸附時間—解吸率；C：吸附時間—總黃酮純度。

2.4.4 泄露曲線考察 稱取AB-8濕樹脂15 g濕法裝柱(1 BV=16.7 mL)，精密量取1.455 mg/mL的上樣液80 mL，以膠頭滴管緩慢地沿著柱子內(nèi)壁加入上樣，保持體積流量為1.5 BV/h，待柱子下端開始流出過柱液時，每5 mL收集一次，共收集16管并對其進行總黃酮質(zhì)量濃度測定。

從圖3中可以看出，在上樣液體積為55 mL，即2.99 BV時，過柱液中總黃酮質(zhì)量濃度為0.139 mg/mL，可認為未出現(xiàn)明顯泄露；當上樣液體積為60 mL，即3.29 BV時，已經(jīng)發(fā)生明顯的泄露現(xiàn)象。故最大上樣體積不應該超過3 BV為宜。

圖3 琴葉榕總黃酮在AB-8型大孔樹脂的泄露曲線

2.4.5 正交試驗 在預實驗及前述結(jié)果的基礎上，將樹脂投入比值、洗脫溶劑用量、體積流量及徑高比四個因素納入考察范圍，每個因素設置3個水平，采用L9(34)正交表安排試驗，每個試驗號重復一次試驗。以總黃酮純度作為指標，稀釋“2.1”中剩余的濃縮液得到上樣液(總黃酮含量為1.455 mg/mL)，選擇70%的乙醇溶液作為洗脫溶劑，具體結(jié)果及分析見表4、表5、表6。經(jīng)直觀分析可知，各因素對精制工藝影響的主次順序為：D>C>B>A。方差分析中顯示，四個因素均對AB-8型大孔樹脂純化琴葉榕總黃酮的工藝具有顯著影響。綜合單因素及正交試驗的實驗結(jié)果比較可知，最佳的富集工藝應為A3B2C1D3，純化得到的總黃酮質(zhì)量為192.33 mg；即上樣液體積為3 BV(含總黃酮質(zhì)量濃度為1.455 mg/mL)，70%乙醇作為洗脫溶劑的用量為2.5 BV，過柱及洗脫時體積流量均為1.5 BV/h，AB-8型大孔樹脂精制琴葉榕總黃酮的徑高比值為1∶15。

表4 因素水平

表5 AB-8大孔樹脂富集琴葉榕總黃酮的工藝正交試驗分析

表6 試驗結(jié)果方差分析

3 討論

大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機溶劑的有機高聚物吸附劑，具有選擇性好、操作簡單、適用范圍廣等特點，在很多領域都有廣泛的應用[4]，可分為極性、弱極性和非極性三大類[5]。

本實驗根據(jù)極性的不同，選取了三種常用的大孔樹脂作為考察對象，結(jié)果顯示弱極性的AB-8型樹脂對于琴葉榕總黃酮的純化具有比較好的效果，在其最佳工藝條件下，總黃酮轉(zhuǎn)移率為93.50%，純度為34.36%，可以為下一步藥理作用研究所需的藥效成分富集起引向作用。此外，單因素試驗表明上樣濃度過高則會堵塞樹脂柱或上樣體積超出樹脂的吸附極限時，均達不到理想的純化效果，故進行琴葉榕目標成分富集時，應將濃縮過的上樣液進行除雜處理，以提高效率及避免損失。正交試驗發(fā)現(xiàn)，往往樹脂的徑高比越大，總黃酮的純度也越高，這可能是隨著理論塔板數(shù)的增多而使得樹脂的除雜能力增強所致；體積流量越快，則產(chǎn)物中所含雜質(zhì)越多，可能是由于藥材各成分與樹脂之間的作用時間過短而吸附力不夠，使得同等流速的洗脫作用的選擇性差。