陳常榮，魏學(xué)軍，趙鴻賓，王 恒，許鍵煒

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻558013；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004)

近年來，隨著創(chuàng)傷所致骨折越來越多，其康復(fù)受到人們越來越多的關(guān)注和臨床的重視。苗藥加九留又名四塊瓦，為金粟蘭科植物寬葉金粟蘭(ChloranthushenryiHemsl)的根。該植物生于山野林下陰濕處和灌叢中，貴州東部地區(qū)有較多資源，具有舒經(jīng)活絡(luò)、清熱解毒、祛風(fēng)止痛、消腫等功效，因此在無名腫毒、肺結(jié)核、風(fēng)濕痹痛、發(fā)熱、跌打損傷、骨折等的治療中具有較好的效果[1]。本研究主要探討其對骨折愈合及軟組織損傷后的修復(fù)效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 動(dòng)物與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年體重為200～240 g的100只SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

購買苗藥加九留，經(jīng)相關(guān)專家鑒定為寬葉金粟蘭的根。取苗藥加九留5 kg，加60%乙醇加熱回流提取2次，合并濾液，將乙醇回收，等水溶液縮至一定體積后，將明膠沉淀雜質(zhì)加入一種，用乙醇將多余明膠除去，并將乙醇回收，水溶液析出無色結(jié)晶，該結(jié)晶的水溶液即為本次實(shí)驗(yàn)中使用的藥物苗藥加九留。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

將100只SD大鼠隨機(jī)分為苗藥加九留高劑量組、苗藥加九留低劑量組、模型組、假手術(shù)組。每組25只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束保證每組存活20只以上。

2.2 建模

向大鼠腹腔中注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，并使其處于仰臥位后固定，將其左后肢的毛發(fā)去除，對其皮膚進(jìn)行消毒，于左后肢脛骨粗隆下外側(cè)，縱行做一個(gè)1.5～2 cm的切口，將肌肉組織分離，使脛骨充分暴露出來，在脛骨粗隆下約1 cm處，使用特制鋼鋸橫向?qū)⒚劰卿彸? mm寬、2 mm深的骨缺損，然后縫合，包扎傷口，但不固定。其中假手術(shù)組在建模時(shí)不做骨損傷，其余同上。

2.3 給藥

各組手術(shù)后開始均灌胃給藥，每日1次。其中模型組和假手術(shù)組灌胃蒸餾水20 mL/kg，苗藥加九留高劑量組為20 mg/kg，苗藥加九留低劑量組為10 mg/kg。灌胃容積均為20 mL/kg，連續(xù)灌胃28 d。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 骨折肢X線評(píng)分[2]四組大鼠接受治療7、14、21、28 d后均接受X線片拍攝，觀察其變化特征：①錯(cuò)位：已缺損脛骨無錯(cuò)位或者包括錯(cuò)位<0.1 cm記為1分；否則記為0分。②骨折縫：已缺損脛骨骨折縫部分模糊或消失記為1分；否則記為0分。③連接：已缺損脛骨骨折斷端連接為一整體記為1分；否則記為0分。④愈合：骨折愈合記為1分；否則記為0分。

2.4.2 BMP-7 采用免疫組化S-P法染色觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)在骨愈合標(biāo)本細(xì)胞中的表達(dá)。

2.4.3 骨折愈合組織抗折強(qiáng)度 末次給藥后次日，每組用10只SD。乙醚麻醉處死動(dòng)物，剖取骨折肢腿骨，固定股骨端，以脛骨骨折處作支點(diǎn)，在距支點(diǎn)10 mm處用便攜秤施壓，記錄脛骨骨折處斷裂時(shí)承受的壓力。

2.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血(4 mL)，普通離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，分離血清。采用雙抗夾心ELISA試劑盒測定大鼠堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGFβ1)含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨折肢X線評(píng)分比較

苗藥加九留高劑量組、低劑量組大鼠骨折X線評(píng)分明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠骨折肢X線評(píng)分比較

3.2 各組大鼠骨愈合標(biāo)本細(xì)胞BMP-7表達(dá)水平比較

運(yùn)用Image-ProPlus6.0軟件對各組各時(shí)點(diǎn)的免疫組化圖像進(jìn)行分析，測定BMP-7平均光密度(MOD)值，結(jié)果表明苗藥加九留高劑量組、低劑量組大鼠BMP-7表達(dá)水平均明顯高于模型組，異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨愈合標(biāo)本細(xì)胞中BMP-7表達(dá)A值比較

3.3 各組大鼠抗折強(qiáng)度比較

苗藥加九留高劑量組、低劑量組大鼠愈合組織抗折強(qiáng)度明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠骨折愈合組織抗折強(qiáng)度比較

3.4 各組大鼠血清bFGF和TGFβ1水平比較

苗藥加九留高劑量組、低劑量組、模型組大鼠bFGF表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與模型組比較，苗藥加九留高劑量組、低劑量組大鼠bFGF表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。苗藥加九留高劑量組、模型組大鼠TGFβ1表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與模型組比較，苗藥加九留高劑量組、低劑量組大鼠TGFβ1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各組大鼠血清bFGF和TGFβ1水平比較

4 討論

苗藥加九留具有舒經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)止痛、清熱解毒、消腫等功效，可用于肺結(jié)核、無名腫毒、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、發(fā)熱、骨折等的治療。研究發(fā)現(xiàn)，寬葉金粟蘭根中分離鑒定出8個(gè)化合物，分別為curcolonol(Ⅰ)、zedo arofuran(Ⅱ)、shizukanolide E(Ⅲ)、異嗪皮啶-7-O-葡糖苷(Ⅳ)、傘形花內(nèi)酯苷(Ⅴ)、異嗪皮啶-3-D-芹菜糖(1→3)-D-葡糖苷(Ⅵ)、谷甾醇(Ⅶ)、胡蘿卜苷(Ⅷ)[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有收縮子宮的作用[4]。苗藥加九留在民間的使用僅僅停留在經(jīng)驗(yàn)方上面，缺少理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)支撐。本研究結(jié)果表明苗藥加九留可以促進(jìn)大鼠骨折端 軟骨細(xì)胞骨化，進(jìn)而有效促進(jìn)骨折愈合。此外，苗藥加九可以促進(jìn)大鼠骨折折斷軟骨端骨膜反應(yīng)以及骨痂生成，并促進(jìn)骨痂質(zhì)量的提高，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)骨折愈合組織抗折斷力的提高。骨折愈合是機(jī)體對創(chuàng)傷修復(fù)的復(fù)雜過程，影響骨折愈合的因素很多。目前研究較多的骨生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP)[5-6]。BMP-7在誘導(dǎo)成骨過程中，可以有效刺激成骨蛋白DNA、膠原合成及蛋白質(zhì)積聚增殖，進(jìn)而促使骨折修復(fù)[7-8]。bFGF具有廣泛的有絲分裂和細(xì)胞存活活性，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)、腫瘤生長和侵襲等多種生物學(xué)過程。研究顯示，bFGF還能通過與bFGF-1受體結(jié)合并激活磷酸肌醇3激酶的形式，以加速增殖的血清形式作用于成骨前細(xì)胞[9]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)也是參與骨愈合和骨生成的一種重要的細(xì)胞因子；TGF-β是屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族的多功能細(xì)胞因子，其受體由1型和2型受體亞基組成。在與TGF-β結(jié)合后，2型受體激酶磷酸化并激活信號(hào)級(jí)聯(lián)的1型受體激酶，導(dǎo)致不同的下游底物和調(diào)節(jié)蛋白的激活，誘導(dǎo)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄，在許多免疫細(xì)胞的分化、趨化、增殖和活化有重要作用[10]。

本研究表明，苗藥加九留對實(shí)驗(yàn)性大鼠骨折有促進(jìn)愈合的作用，可能是通過提高BMP-7、bFGF、TGF-β的表達(dá)促進(jìn)骨折愈合。