陳 丹，劉 佳，吳 丹

(四川大學(xué)華西醫(yī)院 廣安醫(yī)院，四川 廣安 638500)

肺癌是男性最常被診斷出的癌癥。2018年，約有210萬新發(fā)病例，在所有癌癥類型中排名第一，也是癌癥死亡的主要原因，占癌癥死亡人數(shù)的近五分之一，與大多數(shù)國家相比，中國的肺癌死亡率相對較高。預(yù)計到2030年，中國的肺癌死亡率可能會增加約40%[1-3]。目前，肺癌切除術(shù)是臨床上治療早期肺癌最重要的方法之一[4]。越來越多的證據(jù)表明，外科切除術(shù)中使用的麻醉劑也具有一定的非麻醉生理作用，這可能會影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移能力[5-6]。七氟醚(Sevoflurane, SEV)是一種臨床常用的揮發(fā)性麻醉劑，先前的研究表明，七氟醚可能在多種腫瘤中發(fā)揮作用，例如肺癌[7]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]。這些報道表明七氟醚在惡性腫瘤中具有潛在的臨床應(yīng)用價值，但其對肺癌細(xì)胞惡性行為的分子機制尚未完全闡明。新的資料顯示，長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA, lncRNA)Gm15621的過表達通過抑制微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)-133a/Sox4，減輕七氟醚治療引起的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[10]，lncRNA SNHG1通過下調(diào)miR-181b介導(dǎo)七氟醚調(diào)控的神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥[11]，可見lncRNA和miRNA參與七氟醚的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡調(diào)控過程。lncRNA Maternally expressed gene 3(MEG3)在肺癌組織和細(xì)胞中低表達[12]，miR-23a-3p在肺癌組織和細(xì)胞中高表達[13]，二者在肺癌發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。然而，七氟醚是否通過MEG3調(diào)控miR-23a-3p來影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，以及MEG3與miR-23a-3p的靶向調(diào)控作用，目前仍不清楚。因此，本研究考察七氟醚對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并結(jié)合MEG3與miR-23a-3p，旨在闡明其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人正常肺粘膜細(xì)胞GES-1、肺癌細(xì)胞A549購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；miR-23a-3p、miR-23a-3p陰性對照miR-con、si-MEG3、si-MEG3陰性對照si-con購自上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自日本Dojindo公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、二辛可寧酸(Bicinchoninic acid, BCA)蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)、兔抗β肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞GES-1、A549在包含10% FBS、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，并在37℃、5% CO2、飽和濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。七氟醚對細(xì)胞的處理參考先前的研究[14]，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，保持在無菌密閉容器中。容器入口處連接七氟醚揮發(fā)器，用于供應(yīng)七氟醚氣體。細(xì)胞于1.7%、3.4%、5.1%濃度的七氟醚氣體(與95% O2和5% CO2混合)中保持6 h，然后在正常條件下培養(yǎng)24 h，之后進行分析。對照組的細(xì)胞僅用95% O2和5% CO2的混合處理。其中，容器中七氟醚的濃度通過PM8060氣體監(jiān)測儀進行監(jiān)測，監(jiān)測儀連接到容器的出口。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 實驗分組：確定七氟醚最佳作用濃度時，將A549細(xì)胞分為對照組(Control組)、1.7% SEV組(細(xì)胞給予1.7%七氟醚)、3.4% SEV組(細(xì)胞給予3.4%七氟醚)、5.1% SEV組(細(xì)胞給予5.1%七氟醚)。之后將A549細(xì)胞分為Control組(細(xì)胞正常培養(yǎng))、Control+si-con組(細(xì)胞正常培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染si-con)、Control+si-MEG3組(細(xì)胞正常培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染si-MEG3)、SEV組(細(xì)胞給予5.1%七氟醚)、SEV+si-con組(細(xì)胞給予5.1%七氟醚并轉(zhuǎn)染si-con)、SEV+si-MEG3組(細(xì)胞給予5.1%七氟醚并轉(zhuǎn)染si-MEG3)、SEV+miR-23a-3p組(細(xì)胞給予5.1%七氟醚并轉(zhuǎn)染miR-23a-3p)，以檢測七氟醚對肺癌細(xì)胞A549增殖和凋亡的影響與機制。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：A549細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板，待細(xì)胞達70%左右匯合時，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書的指示，將miR-con、miR-23a-3p(轉(zhuǎn)染效率為81.25%)、si-con、si-MEG3(轉(zhuǎn)染效率為84.13%)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h。

1.4 CCK-8檢測A549細(xì)胞的增殖 收集Control組、1.7% SEV組、3.4% SEV組、5.1% SEV組、SEV+si-MEG3組和SEV+miR-23a-3p組A549細(xì)胞，以1×104個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入10 μL CCK-8溶液孵育，1 h后于酶標(biāo)儀450 nm波長處測量吸光度A值，用于表示細(xì)胞活力。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞A549的凋亡 選取Control組、SEV組(5.1% SEV)、SEV+si-MEG3組、SEV+miR-23a-3p組A549細(xì)胞，遵循細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的規(guī)程，在Binding Buffer稀釋細(xì)胞，收集1×105個細(xì)胞，分別加入5 μL 磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μL碘化丙啶工作液，避光反應(yīng)，15 min于流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 向Control組、SEV組(5.1% SEV)、SEV+si-MEG3組、SEV+miR-23a-3p組A549細(xì)胞中加入RIPA裂解液以提取蛋白，通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白定量后，取50 μg蛋白樣品進行10%的SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜。隨后將膜放入5%脫脂奶粉封閉，加入1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，第2天加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，加入增強化學(xué)發(fā)光液顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析Bax、Bcl-2蛋白相對表達量。

1.7 qRT-PCR檢測MEG3和miR-23a-3p表達 使用TRIzol試劑人正常肺粘膜GES-1細(xì)胞和各處理組A549細(xì)胞中提取總RNA，用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)。MEG3和miR-23a-3p的表達分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和U6為內(nèi)參照，由2-ΔΔCt方法計算得出。引物序列為：MEG3上游5’-GGCTGCAGACGTTAATGAGG-3’和下游5’-GAAATGTCGGCTCCATCACC-3’，GAPDH上游5’-AGCCACATCGCTCAG ACAC-3’和下游5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’，miR-23a-3p上游5’-GCGATCAC ATTGCCAGGG-3’和下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，U6上游5’-GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT-3’和下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶活性實驗分析MEG3與miR-23a-3p的靶向關(guān)系 通過starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測MEG3與miR-23a-3p存在互補配對的堿基序列。建立含有miR-23a-3p結(jié)合位點的MEG3-3′UTR野生型(WT)和突變型(MUT)片段，并分別克隆重組到熒光素酶報告質(zhì)粒中，以合成MEG3(WT)和MEG3(MUT)質(zhì)粒。參照方法1.3所述，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑在A549細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-con或miR-23a-3p與MEG3(WT)或MEG3(MUT)，分別記為miR-con組或miR-23a-3p組。48 h后進行雙熒光素酶活性測定。

2 結(jié)果

2.1 七氟醚對肺癌細(xì)胞A549增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果如表1所示，與Control組比較，1.7%、3.4%和5.1% SEV組A549的活力顯著降低(P<0.05)；與1.7% SEV組比較，3.4% 和5.1% SEV組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與3.4% SEV組比較，5.1% SEV組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。其中，以5.1%的七氟醚差異最顯著，因此后續(xù)實驗七氟醚的濃度選取5.1%。

表1 不同濃度七氟醚對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 七氟醚對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測結(jié)果如表2和圖1、2所示，與Control組比較，七氟醚組A549細(xì)胞的凋亡率明顯增加，Bax蛋白表達量明顯升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 七氟醚對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

圖2 Western blot檢測七氟醚對肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表2 七氟醚對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

2.3 lncRNA MEG3和miR-23a-3p在肺癌細(xì)胞A549中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果如表3所示，與人正常肺粘膜細(xì)胞GES-1組比較，肺癌A549細(xì)胞中MEG3表達量明顯減少，miR-23a-3p表達量顯著增加(P<0.05)。

表3 qRT-PCR檢測MEG3和miR-23a-3p在肺癌A549細(xì)胞中的表達

2.4 MEG3與miR-23a-3p的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果如圖3所示，MEG3與miR-23a-3p存在互補的核苷酸序列。雙熒光素酶活性實驗結(jié)果如表4所示，與miR-con組比較，miR-23a-3p組明顯抑制轉(zhuǎn)染MEG3(WT)細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，而對轉(zhuǎn)染MEG3(MUT)細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。

圖3 MEG3與miR-23a-3p的結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶活性檢測肺癌A549細(xì)胞中MEG3與miR-23a-3p的靶向關(guān)系

2.5 七氟醚通過MEG3抑制miR-23a-3p的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果如表5所示，與Control組比較，Control+si-con組肺癌細(xì)胞A549中MEG3和miR-23a-3p的表達無明顯差異(P>0.05)；Control+si-MEG3組細(xì)胞A549的MEG3表達量明顯減少，miR-23a-3p表達量顯著增加(P<0.05)；SEV組、SEV+si-con組細(xì)胞A549中MEG3的表達量均明顯增加，miR-23a-3p表達量均顯著減少(P<0.05)。與SEV組比較，SEV+si-MEG3組細(xì)胞A549中MEG3的表達量顯著降低，miR-23a-3p表達量明顯升高(P<0.05)。

表5 qRT-PCR檢測各組肺癌細(xì)胞A549中MEG3和miR-23a-3p的表達

2.6 七氟醚通過MEG3調(diào)控miR-23a-3p對肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡的影響 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測結(jié)果如表6、圖4和圖5所示，與Control組比較，SEV組A549細(xì)胞的miR-23a-3p表達量、細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax蛋白表達量明顯增加，Bcl-2蛋白表達量顯著減少(P<0.05)。與SEV組比較，SEV+si-MEG3組和SEV+miR-23a-3p組A549細(xì)胞的miR-23a-3p表達量、細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白表達量明顯減少，Bcl-2蛋白表達量顯著增加(P<0.05)。

圖4 七氟醚通過MEG3調(diào)控miR-23a-3p對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

圖5 七氟醚通過MEG3調(diào)控miR-23a-3p對肺癌A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表6 七氟醚通過MEG3調(diào)控miR-23a-3p對肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3 討論

七氟醚是一種無色，易揮發(fā)且不易燃的液體，具有特殊的氣味。在世界范圍內(nèi)，七氟醚被公認(rèn)為用于臨床實踐的安全可靠的麻醉劑[15]。近年來，七氟醚在各種腫瘤中的治療作用逐漸被證實。根據(jù)報道，七氟醚可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[16]、骨肉瘤細(xì)胞的凋亡[17]，并降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤[18]、結(jié)直腸癌[19]細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些研究揭示了七氟醚的抗腫瘤活性，提示七氟醚可用作治療癌癥的潛在靶標(biāo)藥物。Hirai等[20]的研究顯示，七氟醚減慢了兩種癌細(xì)胞系A(chǔ)549和MCF-7以及非癌MCF10A細(xì)胞系的增殖。Wang等[15]的研究結(jié)果顯示，3%七氟醚對A549細(xì)胞進行預(yù)處理可以改變幾種凋亡相關(guān)的miRNA，增加肺癌細(xì)胞的凋亡率，并減少癌細(xì)胞的數(shù)量。然而，關(guān)于七氟醚對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的機理尚不清楚。在本研究中，我們用1.7%、3.4%和5.1%濃度的七氟醚處理A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)七氟醚顯著抑制了肺癌細(xì)胞的增殖。并且，隨著七氟醚濃度的增加，其對肺癌細(xì)胞的抗增殖作用越顯著。后續(xù)研究針對5.1%濃度的七氟醚展開實驗。

促進腫瘤細(xì)胞凋亡是細(xì)胞毒性抗腫瘤藥的重要特征之一[21-22]。在本研究中，流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明，七氟醚可以提高A549細(xì)胞的凋亡率。Bcl-2和Bax是參與細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[23]。Yang等[24]報道了七氟醚誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌FaDu和CAL-27細(xì)胞的凋亡，以及抑制Bcl-2的表達。本實驗觀察到同樣的結(jié)果，即七氟醚明顯下調(diào)Bcl-2的表達，而顯著上調(diào)Bax的表達，表明七氟醚通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax軸促進肺癌細(xì)胞的凋亡?？傮w而言，這些結(jié)果表明七氟醚可能通過抑制肺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤功能，與前人報道[25]相符。

lncRNA是一類進化上高度保守的非編碼RNA，其長度超過200個核苷酸。LncRNA在不同的細(xì)胞過程起著重要作用，如基因表達的調(diào)節(jié)，細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移[26]。MEG3是已鑒定的lncRNA之一，在癌癥異常表達，被證明在許多癌癥中起抗腫瘤作用，例如，乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌，宮頸癌等[27]。非小細(xì)胞肺癌組織、A549和HCC823細(xì)胞株中MEG3的表達明顯低于正常組，MEG3過表達導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡增加，還可抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2并促進細(xì)胞凋亡促進因子Bax的表達，MEG3的這些作用是通過競爭性結(jié)合miR-7-5p來調(diào)節(jié)BRCA1表達而實現(xiàn)的[28]。本項研究檢測到，肺癌細(xì)胞A549中的MEG3水平顯著低于正常肺粘膜細(xì)胞GES-1，這提示MEG3可能抑制肺癌細(xì)胞的進展。Xia等[29]研究指出，MEG3通過減弱肺癌化學(xué)療法中的自噬水平，從而提高長春新堿在肺癌化療中的敏感性?？梢?，MEG3參與一些藥物治療肺癌的進程。接下來，通過siRNA轉(zhuǎn)染建立敲減MEG3，結(jié)果表明，敲減MEG3逆轉(zhuǎn)了七氟醚抑制A549細(xì)胞增殖、miR-23a-3p表達和Bcl-2蛋白表達的作用，并逆轉(zhuǎn)了其促進細(xì)胞凋亡和Bax蛋白表達的作用，證實了MEG3在七氟醚抗肺癌中的潛在作用。

lncRNA充當(dāng)miRNA的海綿，并消除這些miRNA對它們的靶基因的內(nèi)源性抑制作用[30]。本實驗觀察到肺癌細(xì)胞A549中miR-23a-3p表達量上調(diào)，與莫曉媚[13]的報道相同。利用生物信息學(xué)預(yù)測工具發(fā)現(xiàn)，MEG3的3′UTR與miR-23a-3p結(jié)合高度保守。隨后的雙熒光素酶活性實驗則驗證了MEG3對miR-23a-3p的靶向調(diào)控。在肺癌細(xì)胞中過表達miR-23a-3p可以逆轉(zhuǎn)七氟醚對細(xì)胞A549增殖和Bcl-2蛋白表達的抑制作用，以及對細(xì)胞凋亡和Bax蛋白表達的促進作用。這些數(shù)據(jù)表明，MEG3通過靶向miR-23a-3p，可能是七氟醚調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的重要途徑。

綜上所述，在當(dāng)前的研究中，我們探討了七氟醚處理對肺癌細(xì)胞的影響及其功能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟醚可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示出一定的抗腫瘤活性，其作用可能是通過lncRNA MEG3負(fù)向調(diào)控miR-23a-3p的表達來實現(xiàn)的，表明七氟醚可能是肺癌治療中的潛在藥物。