左青青，錢 露，高 瑜，熊 婷，肖佩林，徐 榕，李 林，錢 剛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室 貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)影像學(xué)院2016級本科生，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系2017級本科生，貴州 遵義 563099)

全緣千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don)是具有良好開發(fā)前景的抗菌中草藥[1]，其功用主要表現(xiàn)為對風(fēng)熱感冒、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹瘡癤等感染的治療上[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究揭示，千里光在抗菌、抗鉤端螺旋體、抗滴蟲、抗氧化以及自由基清除活性等方面功效顯著[3]。

染色體核型分析能夠從物種的細(xì)胞學(xué)水平直觀顯示染色體數(shù)目、形態(tài)、整體結(jié)構(gòu)等特征[4-5]，物種之間染色體核型差異可以反映物種遺傳進(jìn)化過程的基本規(guī)律，從系統(tǒng)植物學(xué)的角度揭示物種起源與演化，并由此判斷物種間的親緣關(guān)系，闡明該物種的細(xì)胞遺傳學(xué)機制。因此，核型分析成為物種分類研究的重要依據(jù)，是研究物種的分化、系統(tǒng)演化途徑、親緣關(guān)系、遠(yuǎn)緣雜交及遺傳工程的基本手段[6]，被廣泛應(yīng)用于植物分類學(xué)研究[7]。

我國的菊科千里光族(Senecioneae)植物種類繁多，包括23屬434種[8]，迄今，通過細(xì)胞遺傳學(xué)手段對千里光族植物類群開展的研究極其有限，目前報道的僅涉及橐吾屬、合耳屬、垂頭菊屬等少數(shù)物種[9]，這導(dǎo)致千里光族植物各類群間的界定關(guān)系不明確且缺乏系統(tǒng)性，物種起源與演化仍沒有定論。在此，本文以全緣千里光為研究材料，探討菊科千里光屬近緣物種的演化及系統(tǒng)分類學(xué)特征，為千里光雜交育種的細(xì)胞遺傳學(xué)機制提供基礎(chǔ)試驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料 參試材料全緣千里光野生種群采自貴州省遵義地區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)錢剛教授篩選、檢測，選擇遺傳性狀穩(wěn)定的強抗菌千里光植株為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 材料的扦插 選取生長勢良好、無損傷、無病蟲害的千里光植株，插穗為2～3節(jié)的無葉莖段，長度約10±2 cm，其生長前端的腋芽利用600 mg/L NAA處理2 h，無菌水清洗后扦插于5%的KMnO4溶液消毒后的河沙中，置于22～25 ℃、相對濕度85±5%的溫室，日常管理用MS液體培養(yǎng)基(10 ×)澆灌以保持表層土壤濕潤。30 d后取出扦插株，并用去離子水將根洗凈后置于MS液體培養(yǎng)基(10 ×)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 取材與固定 待根繼續(xù)延伸至2～3 cm時，剪取長度約0.5 cm根尖于冰水混合物，預(yù)處理15 h后，轉(zhuǎn)入新配置的卡諾固定液固定24～48 h。

1.2.3 酶解 將固定后的試驗材料置于0.075 mol/L KCL溶液前低滲處理30 min后，用去離子水沖洗3～5遍，于37 ℃恒溫環(huán)境下，用2.5%果膠酶和2.5%纖維素酶混合液(pH=5.5，由PBS溶解)處理60～90 min之后，用去離子水低滲處理40～60 min，備用。

1.2.4 制片與染色 將試驗材料放置于預(yù)冷的載玻片上，滴加少量雙蒸水以保持根尖處于液體環(huán)境，用解剖針壓平根尖(長度為2～4 mm)，滴加適量卡諾氏固定液，晾干，滴加0.1 μg/mL苯酚品紅染液，染色20 min以上，蓋上蓋玻片后用濾紙吸去多余染液，輕敲蓋玻片、壓片。

1.2.5 染色體檢測與核型分析 染色體標(biāo)本制備完畢，經(jīng)顯微鏡觀察，選擇25個染色體分散良好、著絲點清晰的分裂相用于染色體形態(tài)觀察和數(shù)目的統(tǒng)計，利用Photoshop CS 軟件測量每個細(xì)胞的染色體長臂、短臂和總長度。核型分析標(biāo)準(zhǔn)參考李懋學(xué)和陳瑞陽(1985)[10]的方法，二點四區(qū)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)被用于確定著絲粒位置[11]，不對稱性系數(shù)按照Stebbins(1971)[12]方法計算。其中，核型分析相關(guān)參數(shù)如臂比(Arm ratio)、染色體相對長度(Index of relative length)、核型不對稱系數(shù)(Asymmetric karyotype coefficient,AKC)和著絲粒指數(shù)(Centromere index)的計算公式如下：臂比=長臂長度/短臂長度；染色體相對長度=(染色體長度/染色體組總長)× 100%；核型不對稱系數(shù)(%)=(染色體長臂總長/全組染色體總長)× 100%；著絲粒指數(shù)(%)=(短臂長度/染色體組全長)× 100%。按Levan(1964)的標(biāo)準(zhǔn)劃分：臂比在1.0～1.7之間為中部著絲粒染色體；臂比在1.7～3.0之間為亞中部著絲粒染色體；臂比在3.0～7.0為亞端部著絲粒染色體；臂比大于7.0者為端部著絲粒染色體。

2 結(jié)果

2.1 染色體組分析 為了確定染色體倍數(shù)，我們選擇細(xì)胞周期中既有處于有絲分裂中期，也有處于有絲分裂中后期的分裂相(見圖1A)。當(dāng)細(xì)胞分裂相處于有絲分裂中期時，每條染色體由兩條染色單體構(gòu)成(見圖1B)；當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂中后期，染色體從著絲粒處分離，每條染色體含有1條染色單體，此時細(xì)胞并沒有一分為二，染色體數(shù)目為40條(見圖1C)，由此確定千里光為二倍體。

A：有絲分裂中期(紅色箭頭)和有絲分裂中后期(黑色箭頭)；B：有絲分裂中期的染色體組(黑色箭頭)；C：有絲分裂中后期的染色體組(黑色箭頭)。

2.2 染色體形態(tài) 選擇細(xì)胞分裂相處于有絲分裂中期的圖片25張，均未發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常的染色體；通過觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰的其它分裂相的細(xì)胞，包括細(xì)胞周期處于中后期或后期的分裂相，也未觀察到隨體和端部著絲粒染色體，染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)均相對穩(wěn)定(見圖2)。

圖2 全緣千里光有絲分裂中期的染色體形態(tài)

2.3 染色體數(shù)目 根據(jù)植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，選取染色體分散良好、形態(tài)清晰的有絲分裂中期的分裂相，此時每條染色體含有1個著絲粒，每條染色體含有2條染色單體的細(xì)胞分裂相，綜合有絲分裂中期和中后期著絲粒的個數(shù)可確定，千里光的染色體數(shù)目為2n=2x=20(見圖3)。

圖3 全緣千里光染色體核型

本研究發(fā)現(xiàn)，10對千里光染色體的組成由8對中部著絲粒染色體(m)和2對亞中部著絲粒染色體(sm)組成，未發(fā)現(xiàn)隨體，核型公式為：2n=2x=20=8m+2sm(2SAT)(見圖4)。

圖4 全緣千里光染色體核型模式分析

2.4 染色體核型參數(shù) 基于植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，在測量每一組染色體的長臂和短臂之后，根據(jù)公式計算其染色體相對長度、臂比、著絲粒指數(shù)以及染色體相對長度指數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果顯示，千里光染色體全長在2.168～2.984 μm，相對長度為8.607～11.847%，臂比值介于1.023～2.267之間，平均臂比值1.408，核型不對稱系數(shù) 為57.78%，最長與最短染色體的比值為1.376。綜合相關(guān)參數(shù)，千里光(菊科-千里光屬)的核型屬2A型(見表1)。

表1 全緣千里光染色體核型參數(shù)

3 討論

關(guān)于千里光族植物系統(tǒng)發(fā)生與演化，目前得到普遍認(rèn)同的觀點是菊科千里光族早期進(jìn)化過程中分化為兩個相對獨立的支系，即千里光支系(X=10)和款冬支系(X=30)，之后千里光族近緣物種的演化沿著這兩個支系進(jìn)行[8,13]。目前，有研究對千里光族幾個代表性物種的系統(tǒng)植物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，千里光屬(X=10)與橐吾屬(X=15)和大風(fēng)草屬(X=15)的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)(Senecio)；與染色體核型基數(shù)相同(X=10)的垂頭菊屬、合耳菊屬的親緣關(guān)系最近[8-9]。本研究結(jié)果顯示，千里光屬中部和亞中部著絲點染色體，未發(fā)現(xiàn)多倍體和非整倍體染色體組，表明千里光屬植物的遺傳特性穩(wěn)定。此外，Stebbins[12]的研究表明，染色體核型進(jìn)化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展，本研究發(fā)現(xiàn)千里光的核型不對稱系數(shù)介于50.57%和69.38%之間(見表1)，即該物種的核型對稱性較高，表明千里光屬植物是進(jìn)化速度緩慢、遺傳性狀穩(wěn)定的原始物種。

鑒于同一物種的染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)等保持相對恒定，植物染色體組的測定及組型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容[14-15]，因此，植物核型分析及相關(guān)參數(shù)不僅有助于揭示植物資源的系統(tǒng)發(fā)生、物種演化以及物種間的親緣關(guān)系[2]，還有助于解析生物的遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機制，進(jìn)而對作物的遺傳育種提供細(xì)胞學(xué)參考資料[16]；于是，核型分析的種間親緣關(guān)系鑒定和植物新品種的選育提供指導(dǎo)作用[17]。本研究中千里光參試資源的核型公式同為2n=2x=20=8m+2sm(2SAT)，屬于典型的對稱性核型，符合2A型分類標(biāo)準(zhǔn)；然而，與已報道的菊科千里光族核型相比較[8]，不對稱系數(shù)、染色體相對長度和臂比值等染色體核型參數(shù)存在差異，表明千里光屬的不同種或亞種之間的染色體結(jié)構(gòu)存在差異。由此推知，千里光屬植物的遺傳育種過程中，染色體結(jié)構(gòu)差別可能會對千里光的遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生影響，其細(xì)胞遺傳機制在于染色體配對障礙的生殖隔離可導(dǎo)致雜種不育。

迄今，就千里光屬植物的不同種或亞種之間分類標(biāo)準(zhǔn)而言，仍采用傳統(tǒng)的植物形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，即以葉片的形態(tài)分為掌裂千里光(SinoseneciopalmatisectusC.Jeffreyet Y.L.Chen)、羽葉千里光(SeneciojacobaceaL.)、麻葉千里光(SeneciocannabifoliusLess.)和全緣千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don)，缺少穩(wěn)定可靠的細(xì)胞和分子水平上的分類依據(jù)。于是，有觀點認(rèn)為，物種的不同種或亞種間核型差異主要體現(xiàn)在染色體數(shù)目和形態(tài)方面的變化，尤其是一些近緣物種[1]；因此，在研究植物種、亞種或不同居群之間的親緣關(guān)系時，由于具有相同數(shù)目的染色體，染色體形態(tài)特征可能是分析物種演化趨勢之關(guān)鍵[18]。此外，有研究證實，無論是在核型公式、核型對稱性，或者隨體的有無，物種不同資源產(chǎn)地的核型均存在細(xì)微差異[19]，可能源自物種長期進(jìn)化過程中，因適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)變異以降低植物對環(huán)境的選擇壓力，進(jìn)而表現(xiàn)為種內(nèi)核型的多態(tài)性；本研究結(jié)果與千里光族其它成員之間染色體核型參數(shù)的差異[9]也印證了這一觀點。