周永強 趙春麗* 薛 娟 丁晶鑫

（貴州中醫(yī)藥大學 藥學院，貴州 貴陽550025）

植物內(nèi)生植物是一種能產(chǎn)生多種生物成分的新型微生物資源，具有重要的研究價值和廣闊的開發(fā)前景。從一些藥用植物中分離某些內(nèi)生菌，利用內(nèi)生真菌發(fā)酵能生產(chǎn)具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的天然活性物質(zhì)來代替藥用植物，可為新藥物的開發(fā)利用提供了新的途徑，具有極大的應(yīng)用價值和開發(fā)潛力[1]。

榛樹有平榛，毛榛，刺榛等12 個品種，我國的種植歷史悠久，資源廣泛，其中種植的最為廣泛的是平榛，在我國黑龍江、吉林、山西、河北等地均有大量種植。榛子樹葉中含有的鞣質(zhì)、紫杉醇等化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降低血糖、降血脂等生物活性。從植物中分離出來的真菌有極大的可能性產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學成分，有較好的利用價值，或?qū)⒑Y選出能產(chǎn)生有效成分的菌種，經(jīng)過育種和基因組的改造等方式，可以得到繁殖周期短，繁殖系數(shù)大，有效產(chǎn)量高，更便于組織工業(yè)化的生產(chǎn)的菌種。因此從植物中分離出內(nèi)生真菌再加以篩選改造，以擴大藥物的來源和發(fā)現(xiàn)新的有效成分，是一件值得探索的工作。

本研究對平榛的內(nèi)生真菌進行分離并鑒定其種屬，對平榛內(nèi)生真菌的種類，其代謝產(chǎn)物的生理活性具有一定的參考意義。

1 材料

1.1 供試菌株

內(nèi)生真菌菌株ZL-6 是從平葉榛葉中分離得到，保存在在貴州中醫(yī)藥大學藥學院生物制藥實驗室。

1.2 主要試劑

Tris Amino、dNTP Mix、DNA Marker、10×Taq Buffer、Taq DNA 聚合酶、GeneRed 核酸染料購于南京諾維贊生物科技有限公司；引物V9D 和引物LS266 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要儀器

光照培養(yǎng)箱（GZX-400EF）、超凈工作臺（CJ-2S）購自天津泰斯特儀器有限公司；滅菌鍋（LDZM-40L）購自上海申安醫(yī)療器械廠；振蕩培養(yǎng)箱（BS-1EA）購自常州市華普達儀器有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel Doc XR+）購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌ZL-6 的形態(tài)學鑒定

圖1 內(nèi)生真菌ZL-6 的形態(tài)特征

圖2 菌ZL-6 的ITS 系統(tǒng)進化樹

將內(nèi)生真菌ZL-6 在超凈工作臺上接種到PDA 培養(yǎng)基平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長滿后觀察培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)、大小、顏色及生長情況。蓋玻片滅菌后傾斜45°角插入PDA 培養(yǎng)基內(nèi)，挑取ZL-6 內(nèi)生真菌菌絲種于插有滅菌過的蓋玻片與PDA 培養(yǎng)基的交叉線處，培養(yǎng)3-5d，待蓋玻片上的菌絲貼附后，撥出，經(jīng)乳酸- 棉蘭染液染色，在光學顯微鏡下觀察真菌結(jié)構(gòu)，對照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學鑒定[2]。

2.2 內(nèi)生真菌ZL-6 的分子鑒定

將于搖床發(fā)酵4d 的內(nèi)生真菌ZL-6 的發(fā)酵液抽濾得到菌絲體，內(nèi)生真菌基因組DNA 使用液氮研磨法提取。內(nèi)生真菌基因組DNA 提取后，采用引物V9D 和LS266 對內(nèi)生真菌進行ITS序列擴增，并將PCR 擴增片段進行測序。將已經(jīng)測得的序列結(jié)果與GenBank 中已知序列進行比較分析，再從Genbank 數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)菌的種屬的ITS 序列信息，應(yīng)用MEGA5.05 軟件進行多序列比對，構(gòu)件系統(tǒng)進化樹[3]。

3 結(jié)果與分析

3.1 平葉榛內(nèi)生真菌ZL-6 的形態(tài)學

菌株ZL-6 在PDA 平板生長7 d 時，單菌落表面不平，菌落中心色澤為褐色，菌落邊緣帶白色。菌落質(zhì)地絮狀，菌落較厚，平坦，呈圓形生長，部分有滲出液。主要顯微形態(tài)特征菌絲彎曲鏈狀，有少量暗色的梨型分生孢子，既有橫隔又有縱隔。根據(jù)菌株ZL-6 的形態(tài)學特征將其鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）（圖1）。

3.2 平葉榛內(nèi)生真菌ZL-6 分子鑒定

內(nèi)生真菌ZL-6 的DNA 模板經(jīng)ITS 區(qū)經(jīng)引物V9D 和LS266 擴增、PCR 產(chǎn)物測序得到1009bp 的rDNA 序列。

將所測內(nèi)生真菌ZL-6 的擴增產(chǎn)物序列輸入NCBI 中進行Blast 序列比對分析，篩選出與內(nèi)生真菌ZL-6 種屬最相似的序列，并用MEGA5.05 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，在進化樹中，內(nèi)生真菌ZL-6 與Alternaria alternata GU797138 聚類在同一分支（圖2），親緣關(guān)系最為接近，結(jié)合在GenBank 中登錄結(jié)果顯示二者相似度為100%，同時，結(jié)合ZL-6 的形態(tài)學特征，最終將菌株ZL-6 鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）。

4 結(jié)論

本研究首次從平葉榛的葉中分離得到內(nèi)生真菌ZL-6，并采用形態(tài)學及分子鑒定方法將其鑒定為Alternaria alternata（鏈格孢屬）。研究結(jié)果將為榛樹內(nèi)生真菌的分離及鑒定提供了參考。