郭錦濤，李俊，岳德亮

信陽市中心醫(yī)院普通外科，河南 信陽 464000

胃癌是一種上消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列，隨著生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，胃癌發(fā)病率逐年升高[1]，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。目前，臨床常采用規(guī)范化手術(shù)、放化療等綜合治療方案治療胃癌，但部分中晚期患者仍可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良[2]。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是預(yù)后不良的重要因素，順鉑作為胃癌化療的一線藥物，其耐藥性受到臨床廣泛關(guān)注。原鈣黏蛋白10（procadherin 10，PCDH10）屬于鈣黏蛋白超家族亞群成員，多項(xiàng)研究表明，PCDH10是一種腫瘤細(xì)胞抑制基因[3-5]，在舌鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中均呈異常低表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。目前，關(guān)于PCDH10對(duì)順鉑化療敏感性影響及機(jī)制的研究較少。多種惡性腫瘤中均存在磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路異常激活，且該通路存在一個(gè)重要的下游信號(hào)分子，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR），而p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6）是MTOR的直接底物，該通路在促進(jìn)腫瘤放化療抵抗上具有重要作用[6-7]，由此推測(cè)，PCDH10可通過調(diào)控PI3K/AKT/MTOR/p70S6通路參與胃癌對(duì)順鉑的耐藥進(jìn)程。為驗(yàn)證該猜想，本研究通過建立過表達(dá)PCDH10的人胃癌BGC823細(xì)胞株，探討PCDH10對(duì)順鉑化療敏感性的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人胃癌BGC823細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，pcDNA3.1+PCDH10質(zhì)粒、pcDNA3.1+空質(zhì)粒均購(gòu)自云舟生物科技（廣州）有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、lipofectamineTM2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購(gòu)自日本TCI公司，lipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。NIB900-FL型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自廣州市明慧科技有限公司，7500 Real-Time定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific-CN公司，Spectra Max iD5酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)molecular devices公司，PE2400電泳儀、GelDOC2000型凝膠成像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad中國(guó)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌BGC823細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃恒溫、恒濕箱，5% CO2環(huán)境中孵育培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞長(zhǎng)滿75%瓶底面積時(shí)，更換為無雙抗的完全培養(yǎng)基。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將pcDNA3.1+PCDH10質(zhì)粒、pcDNA3.1+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胃癌BGC823細(xì)胞株，分別作為轉(zhuǎn)染組、空載組，轉(zhuǎn)染36 h后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，將未作任何處理的BGC823細(xì)胞株作為空白組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)PCDH10mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染36 h后的轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，Trizol法裂解提取總RNA，取1 μg經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。按照Takara SYBR Green熒光定量試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：94℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；52℃ 28 s，72℃28 s，共30個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，共22個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸2 min。PCDH10正向引物：5'-TTGACCAGTTGCAGCATGAACG-3'，反向引物 ：5'-GTGAACCTGACTTAGGCACGCC-3'；U6正向引物：5'-TAGCCAGTTGCAGCACCTTATA-3'，反向引物：5'-GGTAGAGACGCCGTGCGCATAC-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 蛋白質(zhì)印記法（Western blot）檢測(cè)PCDH10蛋白的相對(duì)表達(dá)量 按照蛋白提取試劑盒要求獲取轉(zhuǎn)染36 h后的轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，常規(guī)變性后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗（稀釋濃度為1∶500）、二抗（稀釋濃度為1∶1000）孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Fusion軟件計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空載組、空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，重新調(diào)整細(xì)胞密度，以1.0×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，每孔加入20 μl新制備MTT溶液（濃度為5 μg/μl），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后丟棄上層培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO溶液，震蕩均勻后采用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處光密度（optical density，OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，胰蛋白酶消化、重懸；采用無血清培養(yǎng)基洗滌2次后，以2.0×104/ml接種于6孔板，孵育過夜，細(xì)胞鋪滿底壁后丟棄培養(yǎng)基；采用2 μl無菌槍頭劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）輕吹去除劃下細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基孵育24 h后取樣、拍照。細(xì)胞遷移率（%）=（初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為2.0×105/ml。于孔徑8 μm、24孔的Transwell小室的上室中加入200 μl各組細(xì)胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于孵箱中孵育24 h后取出小室。取少量懸液置于計(jì)數(shù)板中，于顯微鏡下觀察穿過濾膜進(jìn)入下室下腔的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 PCDH10對(duì)不同濃度順鉑的敏感性 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，胰蛋白酶消化，重懸，以5.0×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。依次分別向轉(zhuǎn)染組、空載組及空白組細(xì)胞中加入順鉑，使終濃度分別為0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml。采用 MTT法測(cè)定570 nm處OD值，細(xì)胞存活率（%）=（各濃度OD值-空白組OD值）（/0 μg/ml OD值-空白組OD值）。根據(jù)曲線計(jì)算順鉑對(duì)BGC823細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 取部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空白組人胃癌BGC823細(xì)胞，胰蛋白酶消化，重懸，以5.0×103/孔接種于96孔板。分別加入IC50濃度的順鉑溶液，即濃度為4.000 μg/ml的順鉑溶液，分別作為轉(zhuǎn)染+順鉑組、順鉑組。培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，重新收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空白組細(xì)胞及轉(zhuǎn)染+順鉑組、順鉑組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定4組細(xì)胞中PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，重復(fù)3次取Ct平均值，以2-△△CT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot檢 測(cè)PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白的相對(duì)表達(dá)量 重新收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染組、空白組細(xì)胞、順鉑組、轉(zhuǎn)染+順鉑組細(xì)胞，PBS沖洗后，加入裂解液冰上裂解35 min，4℃以11 000 r/min離心25 min，取上清；每孔加入200 μl的BCA混合液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉1.5 h，加入一抗、二抗孵育，取出條帶漂洗，避光顯影，以β-actin為內(nèi)參采用Fusion軟件計(jì)算各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCDH10mRNA及PCDH10蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相對(duì)表達(dá)量，均高于空載組和空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和空載組PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.2 增殖能力的比較

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞重新接種并培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD值均低于空載組和空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和空載組細(xì)胞OD值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表2 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表2 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與空載組細(xì)胞比較，P＜0.05

組別空白組空載組轉(zhuǎn)染組F值P值0.3 1±0.0 6 0.3 4±0.0 5 0.9 1±0.0 9 a b 1 2 0.7 3 9 0.0 0 0 0.2 8±0.0 2 0.3 0±0.0 4 0.8 8±0.1 0 a b 1 4 5.1 6 7 0.0 0 0 P C D H 1 0 m R N A P C D H 1 0蛋白

表3 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表3 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與空載組細(xì)胞比較，P＜0.05

空載組0.3 0 8±0.0 2 1 0.5 6 0±0.0 5 9 0.8 0 3±0.0 7 8時(shí)間2 4 h 4 8 h 7 2 h空白組0.3 0 1±0.0 1 9 0.5 5 7±0.0 6 1 0.7 9 6±0.0 8 1轉(zhuǎn)染組0.1 5 6±0.0 1 3 a b 0.2 6 3±0.0 3 1 a b 0.4 0 9±0.0 4 9 a b F值1 1 3.7 4 4 5 3.4 9 0 5 0.6 8 7 P值0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.3 遷移和侵襲能力的比較

培養(yǎng)24 h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)均低于空載組、空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空載組和空白組細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表4）

表4 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

表4 轉(zhuǎn)染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)的比較（±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與空載組細(xì)胞比較，P＜0.05

組別空白組空載組轉(zhuǎn)染組F值P值8 1.0 2±5.9 4 8 3.1 1±5.2 6 5 3.9 7±4.5 8 a b 4 7.2 2 0 0.0 0 0 1 1 4.8 6±1 8.9 0 1 1 9.3 3±1 9.0 4 4 1.0 6±5.9 1 a b 3 8.4 0 3 0.0 0 0遷移率（%）穿膜細(xì)胞數(shù)

2.4 不同順鉑濃度細(xì)胞存活率及IC50的比較

順鉑濃度分別為 0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率均低于空載組和空白組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空載組和空白組細(xì)胞存活率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。轉(zhuǎn)染組順鉑對(duì)細(xì)胞的IC50值（1.52±0.29）μg/ml，均低于空白組（4.31±0.40）μg/ml和空載組（3.98±0.37）μg/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組與空載組順鉑對(duì)細(xì)胞的IC50值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 不同順鉑濃度人胃癌BGC823細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表5 不同順鉑濃度人胃癌BGC823細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與空載組細(xì)胞比較，P＜0.05

順鉑濃度（μ g/m l）0.5 0 0 1.0 0 0 2.0 0 0 4.0 0 0 8.0 0 0空白組9 1.8 5±4.1 3 8 2.5 6±4.8 1 6 5.6 3±5.2 4 5 2.8 9±4.0 1 3 2.0 5±3.5 4空載組8 9.1 3±5.5 2 8 0.2 4±4.9 5 6 3.7 0±5.1 0 5 0.5 2±3.9 5 3 0.3 0±3.6 7轉(zhuǎn)染組7 7.5 7±5.9 4 a b 6 3.3 0±5.2 9 a b 3 8.5 4±4.0 2 a b 2 1.6 9±2.5 0 a b 9.5 3±1.0 8 a b F值1 0.4 1 4 2 1.9 2 8 4 9.2 1 2 1 1 9.3 0 5 8 6.6 5 0 P值0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.5 PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相對(duì)表達(dá)量的組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中轉(zhuǎn)染組、順鉑組、轉(zhuǎn)染+順鉑組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染+順鉑組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染組和順鉑組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞AKT mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表6）

表6 各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表6 各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，P＜0.05；c與順鉑組細(xì)胞比較，P＜0.05

P I 3 K m R N A 0.9 1±0.1 0 0.5 5±0.0 9 a 0.5 7±0.0 8 a 0.2 9±0.0 5 a b c 4 7.9 0 1 0.0 0 0 0.8 2±0.0 8 0.8 0±0.0 7 0.8 1±0.0 9 0.7 9±0.1 0 0.1 1 3 0.9 5 1 0.8 6±0.0 8 0.5 1±0.0 7 a 0.5 6±0.0 9 a 0.2 9±0.0 5 a b c 5 0.3 2 0 0.0 0 0 0.8 4±0.0 9 0.5 6±0.0 7 a 0.5 9±0.0 6 a 0.2 7±0.0 4 a b c 5 9.8 1 7 0.0 0 0空白組轉(zhuǎn)染組順鉑組轉(zhuǎn)染+順鉑組F值P值A(chǔ) K T m R N A M T O R m R N A p 7 0 S 6 m R N A組別

2.6 PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中轉(zhuǎn)染組、順鉑組、轉(zhuǎn)染+順鉑組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6的相對(duì)表達(dá)量和pAKT/AKT均低于空白組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染+順鉑組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6的相對(duì)表達(dá)量和pAKT/AKT均低于轉(zhuǎn)染組和順鉑組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞PI3K、MTOR、p70S6的相對(duì)表達(dá)量和pAKT/AKT比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表7）

表7 各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表7 各組細(xì)胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組細(xì)胞比較，P＜0.05；b與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，P＜0.05；c與順鉑組細(xì)胞比較，P＜0.05

組別空白組轉(zhuǎn)染組順鉑組轉(zhuǎn)染+順鉑組F值P值P I 3 K 0.8 9±0.1 2 0.5 3±0.0 8 a 0.5 9±0.0 7 a 0.2 7±0.0 4 a b c 4 7.4 7 3 0.0 0 0 p A K T/A K T 1.0 4±0.1 2 0.7 9±0.0 8 a 0.8 2±0.0 9 a 0.2 8±0.0 4 a b c 6 7.8 2 0 0.0 0 0 M T O R 0.8 5±0.0 9 0.4 8±0.0 7 a 0.5 1±0.0 8 a 0.2 4±0.0 4 a b c 6 0.0 0 0 0.0 0 0 p 7 0 S 6 0.8 2±0.1 0 0.4 9±0.0 9 a 0.5 5±0.0 8 a 0.2 5±0.0 5 a b c 4 0.6 1 1 0.0 0 0

3 討論

胃癌是多基因、多因素綜合作用導(dǎo)致的惡性腫瘤，環(huán)境、遺傳、生活習(xí)慣及幽門螺桿菌感染等均是其危險(xiǎn)因素[8]。由于該病早期癥狀隱匿且缺乏特異性，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，僅能采用以化療為主的保守治療手段。順鉑是直接作用于DNA的鉑類化療藥，已被廣泛應(yīng)用在胃癌的治療中，可延長(zhǎng)患者生存期，但由于易發(fā)生耐藥，整體療效不佳。目前，細(xì)胞耐藥的相關(guān)機(jī)制并未明確，有學(xué)者認(rèn)為，可能與細(xì)胞增殖及凋亡失衡相關(guān)[9]，且是多基因、多種調(diào)控機(jī)制聯(lián)合作用的結(jié)果。劉蒙等[10]研究顯示，下調(diào)CDH10的表達(dá)可抑制順鉑耐藥細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。PCDH10與肝腸鈣黏蛋白17（liver-intestinecadherin，LI-cadherin，又稱 CDH17）同屬鈣黏蛋白超家族成員，二者生理功能相似，因此，可推測(cè)PCDH10與胃癌患者順鉑耐藥相關(guān)，探討其對(duì)順鉑的敏感性及相關(guān)機(jī)制對(duì)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞耐藥、改善預(yù)后至關(guān)重要。

PCDH10主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間黏附中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道證實(shí)[11-12]，PCDH10基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島異常甲基化，可破壞細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生癌變，且該機(jī)制在多種惡性腫瘤中均存在。田浩等[13]研究顯示，胃癌組織中PCDH10蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，且其表達(dá)水平與胃癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系密切。本研究通過建立過表達(dá)PCDH10的人胃癌BGC823細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞重新接種，轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)的OD值、培養(yǎng)24 h時(shí)的遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)均降低，表明過表達(dá)PCDH10可降低胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，與Ye等[14]關(guān)于PCDH10在肝癌細(xì)胞中作用機(jī)制的研究結(jié)果相似。近年來，臨床對(duì)腫瘤遷移侵襲與化療多藥耐藥間的研究逐漸深入，有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，遷移侵襲相關(guān)信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)[15]。由此可見，腫瘤轉(zhuǎn)移與耐藥性的產(chǎn)生可能并非孤立事件，二者在功能上存在某種聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，不同順鉑濃度下，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率、順鉑對(duì)細(xì)胞的IC50值均低于空白組和空載組細(xì)胞，表明過表達(dá)PCDH10可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

PI3K為蛋白激酶家族成員，AKT為其下游直接效應(yīng)蛋白。細(xì)胞表面的PI3K被胞外刺激信號(hào)激活后，AKT位點(diǎn)被磷酸化，磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）進(jìn)入細(xì)胞中，開啟轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K始動(dòng)生物信息功能，激活下游效應(yīng)基因，啟動(dòng)炎性反應(yīng)。研究顯示，多種惡性腫瘤中普遍存在PI3K/AKT信號(hào)通路的活化[16-17]，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程。李沐涵等[18]使用PI3K/AKT通路抑制劑阻斷該通路后，胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲能力明顯受抑制。MTOR為高度保守進(jìn)化的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)控細(xì)胞分裂與合成代謝，與PI3K/AKT通路密切相關(guān)[19]，可直接被AKT激活或接收生長(zhǎng)因子信號(hào)而活化，進(jìn)一步激活下游蛋白p70S6，進(jìn)而加快肌動(dòng)蛋白細(xì)絲重構(gòu)與mRNA的翻譯過程，調(diào)控蛋白生成，促進(jìn)細(xì)胞增殖。付漢東等[20]研究顯示，MTOR、p70S6在胃癌組織中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，且與疾病臨床與病理特征相關(guān)。本研究中，人胃癌BGC823細(xì)胞經(jīng)PCDH10轉(zhuǎn)染及順鉑干預(yù)后，PI3K、MTOR、p70S6mRNA的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，且PI3K、MTOR、p70S6蛋白的相對(duì)表達(dá)量及pAKT/AKT均降低，且轉(zhuǎn)染+順鉑對(duì)其表達(dá)調(diào)控作用更加顯著，表明過表達(dá)PCDH10增強(qiáng)細(xì)胞順鉑敏感性的機(jī)制可能與下調(diào)PI3K、MTOR、p70S6mRNA及PI3K、MTOR、p70S6蛋白表達(dá)、抑制AKT磷酸化相關(guān)，推測(cè)PCDH10可作為臨床增強(qiáng)胃癌細(xì)胞順鉑敏感性的靶向基因。

綜上所述，PCDH10過表達(dá)可抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，并可增強(qiáng)細(xì)胞順鉑化療敏感性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)PI3K、MTOR、p70S6mRNA 及 PI3K、MTOR、p70S6蛋白表達(dá)、抑制AKT磷酸化相關(guān)。本研究為臨床進(jìn)一步明確PCDH10信號(hào)通路在胃癌多藥耐藥中的作用機(jī)制、逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥提供了理論依據(jù)。