劉變利,王娟妮,劉小青,杜 娟,于銳利,尉春艷*

(1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;2 商洛市商州區(qū)婦幼保健院;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、5年生存率低[1]。深入研究EOC侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn),有望提高EOC患者生存率。實(shí)體腫瘤中的新生血管形成是腫瘤發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的重要過程,當(dāng)腫瘤原有的血管不能滿足生長需求時(shí),一些腫瘤細(xì)胞就會改變它自身的功能、模擬內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn),由腫瘤細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的微血管網(wǎng)絡(luò),這種微血管結(jié)構(gòu)被稱為血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)[2],它被認(rèn)為是惡性腫瘤血管新生的重要補(bǔ)充方式。另外研究發(fā)現(xiàn),在高度VM形成的腫瘤中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的調(diào)節(jié)因子也高表達(dá)[3]。EMT是上皮細(xì)胞失去上皮特征轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的過程[4]。排列緊密的上皮細(xì)胞失去胞間連接、表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面因子并獲得機(jī)動性以及遷移能力,被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟[5],其發(fā)生標(biāo)志是E-cadherin(E-鈣黏蛋白)的丟失[6]。E-cadherin是存在于上皮細(xì)胞中介導(dǎo)胞間黏附的重要因子,是公認(rèn)的上皮標(biāo)志物,編碼基因是CDH1。Twist可直接與CDH1的啟動子區(qū)域結(jié)合,進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)[7]。

Twist屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族,在包括EOC在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中高表達(dá),很多研究已經(jīng)表明Twist與多種癌癥的發(fā)生、侵襲發(fā)展密切相關(guān),并能為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。經(jīng)前期研究[8]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Twist能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖以及侵襲能力,而在實(shí)體腫瘤中,血管生成是必要條件,因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了Twist能否促進(jìn)EOC的新生血管生成以及VM和EMT過程,從而為進(jìn)一步揭示上皮性卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

SKOV3細(xì)胞系購自上海中科院典型培養(yǎng)物保藏中心。Twist-shRNA 771、shRNA782和shRNA864序列合成(上海生工生物工程有限公司),LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen,美國),CD31-PAS雙染試劑盒(天根生化科技有限公司),SYBR Green試劑盒(Applied Biosystems,美國),RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司),DNA膠回收試劑盒(寶生物工程有限公司),Trizol(Invitrogen,美國);real time PCR試劑盒(北京全式金公司),CD31、CD34一抗(eBioscience,美國),E-cadherin一抗(Abcam,英國),Twist一抗(Santa Cruz,美國),Twist和CD31二抗(Santa Cruz,美國)。

細(xì)胞分為四組:Twist過表達(dá)載體組(Twist-over組)和抑制載體組(Twist-shRNA組)以及空白對照組(NC組)和空載體組(empty組)。

1.2 組織樣本

上皮性卵巢癌組織取自西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院行卵巢癌手術(shù)的20例患者,術(shù)前未接受過放化療,根據(jù)FIGO 2012年卵巢癌手術(shù)-病理分期,早期(FIGOⅠ、Ⅱ期)卵巢癌5例,晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ期)卵巢癌15例;高分化者4例,中低分化者16例,年齡26-73歲,平均51歲;對照組為非惡性疾病行單側(cè)或者雙側(cè)卵巢切除的患者,年齡31-73歲,平均53歲。每位患者均同意臨床組織的捐獻(xiàn)并簽署知情同意書,本研究經(jīng)我院人體實(shí)驗(yàn)與倫理委員會批準(zhǔn)。組織切除后均分為兩份:其一用液氮快速冰凍,-80 ℃凍存、檢測RNA表達(dá);另一份石蠟切片后免疫組織化學(xué)染色和CD31-PAS雙重染色。

1.3 Twist-shRNA載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)合成人Twist-shRNA771、shRNA782和shRNA864序列的正向和反向DNA oligos,按以下體系配制退火反應(yīng)體系:正義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μl,反義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μl,dNTPs 10 μl,Taq DNA聚合酶2.5 μl,NaCl 100 mmol/L,Tris-Cl pH 7.4 50 mmol/L,ddH2O 50 μl。運(yùn)行以下PCR程序:90 ℃ 4 min,70 ℃ 10 min,55 ℃ 10 min,40 ℃ 10 min,25 ℃ 10 min。將pLentilox3.7載體(新霉素抗性,Clontech)按以下條件雙酶切:10×緩沖液2 μl,pLentilox3.7 1 μl,EcoR Ⅰ 1 μl,BamH Ⅰ 1 μl,ddH2O 15 μl,37 ℃、3 h。將酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離,膠回收后純化、調(diào)整質(zhì)粒濃度為0.5 μg/μl。按照以下體系連接:T4 DNA連接酶1 μl,酶切后的pLentilox3.7載體1 μl,退火寡核苷酸3 μl,10×連接酶Buffer 1 μl,ddH2O補(bǔ)足10 μl。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌后測序鑒定。

1.4 Western blot檢測Twist和E-cadherin蛋白

裂解細(xì)胞后提取蛋白并檢測濃度。60 V 30 min、100 V 120 min電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉,Twist(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜,洗膜3次,山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)、山羊抗小鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜3次后顯影。

1.5 real-time PCR檢測Twist和E-cadherin

Trizol法提取RNA并測定濃度、制備cDNA。Twist引物:5′-CGGGAGTCCGCAGTCTTA-3′、5′-CACGCCCTGTTTCTTTGA-3′,E-cadherin引物:5′-GGGTCTTGCTATGTTGCC-3′、5′-GTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。反應(yīng)程序設(shè)置如下:95 ℃ 3 min,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)包括:95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s。每個(gè)樣品共3個(gè)平行重復(fù),取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 三維細(xì)胞培養(yǎng)

于35 mm培養(yǎng)皿中,將單細(xì)胞懸液滴種到蓋玻片(直徑18 mm)的人工基底膜上,37 ℃、30 min,貼壁加入2.5 ml的DMEM。每2 d換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。

1.7 CD31-PAS雙染

采用鏈霉素抗生物素-過氧化物酶連結(jié)(SP)法,固定腫瘤組織,血管內(nèi)皮呈現(xiàn)棕黃色后,蒸餾水沖洗1 min,過碘酸溶液中氧化15 min,蒸餾水沖洗3 min、2次,Schiff液中避光、PAS反應(yīng)15 min,蒸餾水洗1 min、3次,流水3 min,蘇木精5 min,流水2 min,分化、反藍(lán),常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。CD31表達(dá)陰性,PAS染色陽性的管腔,管腔內(nèi)壁可見扁平腫瘤細(xì)胞覆蓋者為血管生成擬態(tài)。每個(gè)組織隨機(jī)選擇3個(gè)視野,計(jì)數(shù)VM數(shù)目。

1.8 流式細(xì)胞檢測

0.25%胰酶和0.02%EDTA消化細(xì)胞后、離心、PBS重懸,加入4%多聚甲醛,37 ℃ 10 min,冰上1 min。加入終濃度為90%的甲醇冰上放置30 min。2 ml孵育緩沖液漂洗,離心后100 μl孵育緩沖液重懸,室溫封閉10 min,加入CD34和CD31,室溫孵育1 h,2 ml孵育緩沖液漂洗,離心后將細(xì)胞重懸在0.5 ml PBS中,流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS軟件23.0版(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析輔以Bonferroni檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Twist沉默載體構(gòu)建

與空白對照相比,轉(zhuǎn)染Twist-shRNA771、shRNA782和shRNA864載體后SKOV3細(xì)胞中Twist蛋白和mRNA的表達(dá)水平降低(見圖1);且Twist-shRNA782的抑制效率最高,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用該沉默載體。利用Twist-shRNA782抑制載體以及此前實(shí)驗(yàn)構(gòu)建完成的過表達(dá)載體[9]進(jìn)行real-time PCR檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)載體以及沉默載體均可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

與NC組比較,* P <0.05;與shRNA771和shRNA864組比較,#P <0.05圖1 不同Twist-shRNA和過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后Twist的表達(dá)Figure 1 Expression of Twist in SKOV3 after transfected with Twist-shRNAs and Twist-overexression vector

2.2 上皮性卵巢癌組織中血管生成擬態(tài)明顯增多

對上皮性卵巢癌組織和正常組織進(jìn)行CD31染色發(fā)現(xiàn):上皮性卵巢癌組織明顯高表達(dá)CD31(11.65±0.99vs8.10±0.86,P<0.05,見圖2)。對上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織進(jìn)行CD31-PAS雙染后發(fā)現(xiàn):上皮性卵巢癌組織中VM現(xiàn)象很常見,且伴隨缺氧加重VM也越發(fā)明顯;而正常卵巢組織多為組織自有血管,VM很少(5.25±0.56vs1.10±0.45,P<0.05,見圖2)。

箭頭為CD31陰性、PAS陽性;三角為CD31陽性、PAS陽性圖2 上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中的血管生成擬態(tài)Figure 2 VM in epithelial ovarian cancer tissues and normal ovary tissues

2.3 Twist過表達(dá)可使CD31和/或CD34陽性的SKOV3細(xì)胞數(shù)量增加

CD31、CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物,流式篩選結(jié)果顯示:空白組、空載體組以及Twist-shRNA782組間CD31和/或CD34陽性的細(xì)胞數(shù)無明顯差異;而Twist過表達(dá)組中,CD31和/或CD34陽性的SKOV3細(xì)胞明顯增多(P<0.05,見圖3)。

圖3 Twist過表達(dá)可使CD31和/或CD34陽性的SKOV3細(xì)胞數(shù)量增加Figure 3 Overexpression of Twist promotes CD31 and/or CD34 positive rate in SKOV3 cells

2.4 Twist過表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下EMT的形成

對SKOV3細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)以明確Twist對于SKOV3細(xì)胞的EMT有無作用。發(fā)現(xiàn)Twist過表達(dá)組的細(xì)胞變狹長并形成明顯的管腔樣結(jié)構(gòu),而空白組和空載體組只有極少數(shù)細(xì)胞有輕微變形、也沒有管腔樣結(jié)構(gòu)的形成,Twist-shRNA782組的SKOV3細(xì)胞未見明顯改變。Twist過表達(dá)組、空白組、空載組和Twist-shRNA782組EMT的形成依次為6.83±0.49,0.92±0.31,1.41±0.38和1.25±0.39(P<0.05,見圖4)。

圖4 Twist對三維培養(yǎng)后的SKOV3細(xì)胞EMT形成的作用Figure 4 The effect of Twist on EMT formation of SKOV3 cells after 3D culture

2.5 Twist能夠抑制E-cadherin的表達(dá)

E-cadherin作為Twist調(diào)控的下游靶點(diǎn)之一,與多種惡性腫瘤中EMT的發(fā)生和發(fā)展、VM的發(fā)生密切相關(guān)。SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染Twist過表達(dá)載體48 h,E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低(見圖5);轉(zhuǎn)染抑制載體shRNA782 48 h,結(jié)果與過表達(dá)載體相反。

與empty組比較,* P <0.05圖5 Twist過表達(dá)能夠抑制E-cadherin的表達(dá)Figure 5 Twist overexpression inhibits the expression of E-cadherin protein and mRNA

3 討論

Twist基因于1983年首次發(fā)現(xiàn),在胚胎發(fā)育中至關(guān)重要[10],還與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本課題在前期Twist過表達(dá)載體[9]的基礎(chǔ)上再次成功構(gòu)建抑制載體Twist-shRNA782,用以研究Twist對SKOV3細(xì)胞在促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的新生血管生成、EMT中的作用。

惡性腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,需要豐富的血液供應(yīng)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的原有血管不能滿足腫瘤生長需求后,腫瘤細(xì)胞會改變其自身功能、模擬內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)由非內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的微血管網(wǎng),也就是VM,它不僅為癌細(xì)胞提供營養(yǎng),關(guān)鍵是其本質(zhì)是由腫瘤細(xì)胞自身變形而來,直接增加了腫瘤與血液的接觸機(jī)會,使腫瘤細(xì)胞更易侵襲轉(zhuǎn)移[11]。本研究中CD31-PAS雙染結(jié)果顯示上皮性卵巢癌組織可見非內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血管腔內(nèi)壁,并可見到腔內(nèi)有紅細(xì)胞,在壞死區(qū)域更為明顯,說明上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖導(dǎo)致癌灶中心區(qū)缺氧,缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自身變形并形成管腔樣結(jié)構(gòu),以適應(yīng)自身血供要求。通過構(gòu)建的兩種Twist表達(dá)載體進(jìn)一步研究Twist對于SKOV3細(xì)胞參與血管生成的影響發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Twist可導(dǎo)致CD31和/或CD34陽性的SKOV3細(xì)胞數(shù)量增加,意味著Twist可以促進(jìn)SKOV3細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,可能是促進(jìn)EOC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的輔助因素。

有研究發(fā)現(xiàn),在高度VM形成的腫瘤中,EMT的調(diào)節(jié)因子和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子也高表達(dá)。雖然VM的具體形成機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,但目前認(rèn)為EMT是其發(fā)生的關(guān)鍵因素和步驟。EMT[12]是胞間以及細(xì)胞與胞外間質(zhì)間的連接發(fā)生了改變,導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性、與周圍細(xì)胞脫離,并獲得遷移能力,從而轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的過程,特征是上皮細(xì)胞標(biāo)記物(如黏附分子)表達(dá)減少和間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)增加、胞間缺乏連接、排列松散、黏附減少,脫落轉(zhuǎn)移潛能隨之增加。故EMT與惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲關(guān)系密切[13]。而上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物E-cadherin的丟失是EMT發(fā)生的標(biāo)志[12]。有研究認(rèn)為,Twist高表達(dá)、E-cadherin低表達(dá)可以作為非小細(xì)胞肺癌的重要預(yù)后因子[14],Twist能夠抑制E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腎小管的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及纖維化[15]。對SKOV3細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Twist可導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞變得更加狹長并形成明顯的血管腔樣結(jié)構(gòu),而Twist干擾組則未觀察到明顯變化;在形態(tài)學(xué)上重現(xiàn)了腫瘤初期的轉(zhuǎn)移變化。而過表達(dá)Twist明顯抑制E-cadherin的表達(dá),充分說明Twist能夠抑制E-cadherin、促進(jìn)SKOV3細(xì)胞EMT的發(fā)生。

本研究從腫瘤局部微觀的角度探討了SKOV3細(xì)胞的生長侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,認(rèn)為Twist能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞VM和EMT的形成,從而增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,SKOV3細(xì)胞發(fā)生VM及EMT的具體機(jī)制以及內(nèi)在的時(shí)間點(diǎn)和表達(dá)模式的關(guān)聯(lián)仍有待進(jìn)一步研究。