李家凱 郭康康 劉麗娜

摘要：為了解養(yǎng)殖場家禽中H5、H7、H9亞型禽流感病毒抗體水平，通過血清學(xué)調(diào)查，應(yīng)用血凝抑制試驗（HI）的方法，對四川內(nèi)江、山東濟南、河南鶴壁、江蘇揚州4個定點實驗觀測站負責(zé)的養(yǎng)殖場的雞血液樣本進行禽流感病毒抗體分析，其中包含2個肉雞場和3個蛋雞場。研究發(fā)現(xiàn)蛋雞場通常免疫了H5、H7、H9（或H5與H9）亞型禽流感疫苗，而肉雞場只免疫了H9亞型禽流感疫苗;蛋雞場和肉雞場都存在免疫禽流感疫苗后抗體水平低和無抗體產(chǎn)生的情況，從而導(dǎo)致免疫不合格或免疫失敗。以上結(jié)果表明，應(yīng)加強家禽養(yǎng)殖場對不同亞型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗體水平監(jiān)測，以防免疫失敗，從而預(yù)防禽流感的發(fā)生和流行。

關(guān)鍵詞：肉雞與蛋雞;H5、H7、H9亞型禽流感疫苗;抗體水平;免疫合格率

Abstract： In order to understand the immune antibody level of H5， H7 and H9 subtypes avian influenza virus in poultry， the blood samples of four experimental observation stations in Neijiang city of? Sichuan province， Jinan city of Shandong province， Hebi city of Henan province and Yangzhou city of Jiangsu province were analyzed by serological investigation and hemagglutination inhibition test（HI），including two broiler farms and three layer farms. The research found that layers were immunized with H5， H7， H9（or H5 and H9） subtypes avian influenza vaccines， while broilers were only immunized with H9 subtype avian influenza vaccine. The layer farms and broilers farms had low antibody production after the immunization of avian influenza vaccine， leading to unqualified or immune failure. It is suggested that the immunization different subtypes of avian influenza vaccine and the monitoring of avian influenza antibody levels after immunization should be strengthened to prevent the occurence and prevalence of avian influenza.

Key words： broilers and laying hens; H5， H7， H9 subtypes of avian influenza vaccine; antibody level; qualified rate of immunity

1994年，張澤紀等[1]首次從中國廣東某雞場發(fā)病雞體內(nèi)分離到H9N2亞型病毒。H9N2亞型禽流感病毒滅活苗（以A/Chicken/Shandong/6/1996為疫苗株）自1999年首次在中國被批準使用[2]，此后H9N2單價苗和聯(lián)苗陸續(xù)上市，為中國防控H9N2禽流感的流行發(fā)揮了重要作用。但近年來， H9N2禽流感病毒經(jīng)常從已免疫的雞群中分離到， 這說明H9N2抗原性已在多種因素的作用下發(fā)生了改變， 導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗效力降低甚至失效[3]。因此有必要對不同地區(qū)禽群中的H9N2的流行與變異情況進行實時監(jiān)測， 一方面為生產(chǎn)企業(yè)疫苗種毒的更新提供依據(jù)， 另一方面也可以幫助本地區(qū)的養(yǎng)殖者有針對性地選擇抗原性匹配的疫苗[4]。

1996年，中國首次從廣東省的鵝中分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）A/goose/Guangdong/1/96。2003年以來特別是2004年， 中國暴發(fā)了多起H5亞型高致病性禽流感疫情，給中國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。2005年，中國開始實施H5亞型禽流感的全面免疫政策[5]。從2006年最初推出的Re-1疫苗和Re-4疫苗，到2017年H5 亞型流感疫苗已更新到Re-10[6， 7]。

2013年后H7N9流感病毒在中國活禽交易市場、農(nóng)貿(mào)市場以及禽群中的感染范圍不斷擴大[8]。多家獸醫(yī)機構(gòu)監(jiān)測結(jié)果均表明， 中國H7N9亞型流感病毒的養(yǎng)殖場陽性率和個體陽性率在總體上均呈現(xiàn)逐年上升趨勢， 對家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生嚴重威脅[9]。中國于2017年開始使用重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1Re-8株+H7N9H7-Re1株）， 對全國家禽（包括水禽）實施免疫。在2018年底更新為“重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株， H7N9 H7-Re2株）”等新疫苗，以滿足高致病性禽流感防控的急需[10]。為此，為了解家禽養(yǎng)殖場中H5、H7、H9亞型禽流感病毒的免疫抗體水平，本研究對四川內(nèi)江、山東濟南、河南鶴壁、江蘇揚州4個定點實驗觀測站負責(zé)的5家禽養(yǎng)殖場的雞血液樣本進行流感抗體檢測，分析其禽流感抗體水平及免疫合格率，以期為預(yù)防禽流感的發(fā)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 診斷試劑和紅細胞的制備

禽流感病毒H5、H7、H9亞型血凝抑制試驗診斷抗原和禽流感 H5、H7、H9亞型陰、陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。紅細胞采自實驗室飼養(yǎng)的未經(jīng)疫苗免疫的健康雞，并按照常規(guī)程序制備1%的紅細胞懸液。

1.2 樣品采集

2019年4月對內(nèi)江、濟南、揚州、鶴壁4個地方定點觀測站的雞群采集血清樣本，共采集300份樣品。每只雞通過翅靜脈采血1～2 mL，置于2 mL EP管中。之后4 000 r/min 離心5 min，離心后上層清亮液體即為血清，小心吸取放入1.5 mL EP管中，最后置于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血凝抑制試驗測定樣品的抗體效價

血凝抑制實驗：血凝—血凝抑制試驗（HA-HI試驗，微量法）按照高致病性禽流感診斷技術(shù)和高致病性禽流感免疫技術(shù)標準進行[11]。HI效價測定按高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB/T 18936—2003）進行判定，HI抗體水平按照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準NY/T 769—2004進行判定，即HI抗體≥4log2為免疫合格，抗體合格率70%以上為群體免疫合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞群禽流感疫苗免疫情況

本研究對4個實驗站的5個雞場的雞的品種、日齡、采集樣本數(shù)以及禽流感疫苗免疫情況進行了統(tǒng)計，從表1可知，采集血清樣本主要來源于肉雞和蛋雞，其中肉雞主要免疫H9亞型禽流感疫苗，蛋雞則免疫H5、H7、H9（或H5與H9）亞型流感疫苗。

2.2 雞群禽流感抗體水平及免疫合格率

本研究對4個實驗站5個雞場雞的H5、H7、H9抗體效價以及免疫合格率進行了統(tǒng)計，具體結(jié)果見表2和表3。從表2和表3可以看出，四川內(nèi)江觀測站60份樣本H9抗體平均效價5.6log2，免疫合格率為82%，H7和H5因其沒有免疫，抗體效價和免疫合格率均為0;山東濟南觀測站60份樣本H5、H7、H9抗體平均效價分別為6.43log2、8log2、7.95log2， 其H5、H7、H9免疫合格率均為100%;河南鶴壁觀測站100份樣品未測出H9、H7、H5抗體， H9疫苗免疫合格率為0，H7和H5因其沒有免疫，抗體效價和免疫合格率均為0;江蘇揚州觀測站一場40份樣本H5、H7、H9抗體平均效價分別為0、0、7.9log2，H5疫苗免疫合格率為0，H9疫苗免疫合格率100%，H7因其沒有免疫，抗體效價和免疫合格率均為0; 江蘇揚州觀測站二場40份樣本H5、H7、H9抗體平均效價分別為3.55log2、7.93log2、7.98log，H5免疫合格率為50%，H7、H9免疫合格率均為100%。

3 小結(jié)與討論

3.1 免疫禽流感疫苗無抗體產(chǎn)生

由于肉雞和蛋雞的生產(chǎn)周期不同，免疫疫苗種類也不盡相同，本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)肉雞只免疫H9亞型禽流感疫苗，而蛋雞則免疫H5、H7、H9（或H9與H5）亞型禽流感疫苗。四川內(nèi)江觀測站和河南鶴壁觀測站肉雞場中，四川內(nèi)江站H9抗體群體免疫合格，而河南鶴壁在注射了H9疫苗之后仍未產(chǎn)生抗體效價;江蘇揚州一場蛋雞免疫H5疫苗之后仍未產(chǎn)生H5抗體效價。分析可能是以下幾個方面的原因：各觀測站免疫疫苗的生產(chǎn)廠家不同，這可能是導(dǎo)致各觀測站雞群的禽流感病毒抗體效價和免疫合格率不同的一個原因;其次每個廠的飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)人員的水平也不盡相同，一些管理和操作上的不規(guī)范也是可能導(dǎo)致免疫失敗的重要原因;最后還可能是雞群中本身存在一些免疫抑制病，在免疫后產(chǎn)生了免疫抑制，從而可能導(dǎo)致雞群無相應(yīng)抗體產(chǎn)生。

3.2 免疫禽流感疫苗后禽流感病毒抗體水平和免疫合格率不同

山東濟南和江蘇揚州蛋雞場的H9禽流感抗體水平和免疫合格率都高于四川內(nèi)江和河南鶴壁肉雞場。對現(xiàn)在蛋雞和肉雞的免疫程序進行分析，蛋雞和肉雞禽流感疫苗一般采用以下免疫程序：蛋雞開產(chǎn)前接種4次，15日齡首免，35日齡第2次免疫，80日齡第3次免疫，130日齡第4次免疫， 開產(chǎn)后每3～4個月加強免疫1次;肉雞在2周齡時進行1次免疫。從免疫程序可知蛋雞的免疫次數(shù)高于肉雞，因此可能導(dǎo)致蛋雞場抗體水平和免疫合格率優(yōu)于肉雞場。

通過本次雞群禽流感病毒抗體水平調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肉雞只免疫了H9亞型禽流感疫苗，未免疫H7與H5亞型禽流感疫苗，因此肉雞無法預(yù)防H5與H7亞型禽流感的發(fā)生，因此建議肉雞場應(yīng)該考慮增加H7與H5亞型禽流感疫苗免疫;其次本研究還發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場免疫禽流感疫苗后并沒有產(chǎn)生相應(yīng)的禽流感抗體或者產(chǎn)生相應(yīng)抗體后仍然達不到合格標準，建議養(yǎng)殖場也要加強雞群免疫后禽流感抗體水平監(jiān)測，以防免疫失敗，從而預(yù)防禽流感的發(fā)生和流行。

參考文獻：

[1] 張澤紀，陳伯倫，陳偉斌. 禽流感研究Ⅱ. 禽流感的發(fā)生情況和血清學(xué)調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志，1994（10）：6-7.

[2] LI C L， YU K Z， TIAN G B， et al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].? Virology， 2005， 340：70-83.

[3] 童海兵，張小榮，吳艷濤，等. H9N2亞型禽流感滅活疫苗的免疫效果評價[J]. 中國家禽，2010（20）：22-25.

[4] 叢彥龍，鐘 穎，孫藝學(xué)，等. H9N2亞型禽流感病毒流行病學(xué)及其疫苗的研究進展[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2017（2）：386-392.

[5] 蔣文明，李金平，侯廣宇，等. H5亞型高致病性禽流感病毒抗原性變異分析[J]. 中國動物檢疫，2016（9）：27-32.

[6] ZHAO K K， GU M， ZHONG L， et al. Characterization of three H5N5 and one H5N8 highly pathogenic avian influenza viruses in China[J].? Veterinary microbiology， 2013，163（3-4）.

[7] World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization （WHO/OIE/FAO）H5N1 Evolution Working Group.Revised and pdated nomenclature for highly pathogenic avian influenza A（H5N1） viruses[J]. Influenza other respir viruses，2014，8（3）：384-388.

[8] WANG D， YANG L， GAO R， et al. Genetic tuning of the novel avian influenza A （H7N9） virus during interspecies transmission， China， 2013[J]. Euro surveillance， 2014， 19（25）：20836.

[9] 劉玉良，劉文麗，高曉藝，等. H7N9亞型流感流行病學(xué)特征及防控建議[J]. 中國家禽，2017（19）：1-5.

[10] 李永紅. 2019年春防高致病性禽流感免疫要更換新疫苗[J]. 北方牧業(yè)，2019（04）：15.

[11] GB/T 18936—2003， 高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].