周凱妃，王繼龍，滕艷娟，陳似霞，莫新少

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧 530021）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌[1]，也是全球第五大常見惡性腫瘤[2-3]。此外，由于各種危險因素，HCC的發(fā)病率也有所增加[4]，但目前仍缺乏理想的防治方法。人體腸道菌群存在一定的動態(tài)平衡，在維持人體健康方面具有重要的作用。若腸道菌群的平衡受到各種不良因素的影響，就會形成腸道菌群失調(diào)（intestinal dysbacteriosis，ID），導(dǎo)致或促進各種疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。因此，腸道菌群在生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。近年來，隨著對肝-腸軸認識的逐漸深入，腸道菌群與HCC之間的重要聯(lián)系越來越受到重視[7-8]。一方面，研究顯示ID促進HCC[9]；另一方面，HCC的發(fā)生影響腸道菌群，導(dǎo)致ID的發(fā)生[8,10]，這是一個惡性循環(huán)的過程。因此，肝臟與腸道通過肝-腸軸相關(guān)聯(lián)的特征提示，除了治療肝臟原發(fā)病變外，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)也應(yīng)作為HCC治療的重要靶點[3,11]。了解HCC患者腸道菌群的影響因素，有助于找到腸道菌群調(diào)節(jié)的潛在靶點。然而，目前大多數(shù)關(guān)于腸道菌群與HCC相關(guān)性的研究都是動物實驗。哪些因素是HCC患者腸道菌群的主要影響因素？根據(jù)HCC的特點，綜合考慮各種因素，探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素鮮有報道。因此，本研究的目的是探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素。這些因素與腸道菌群之間的相關(guān)性有助于為HCC患者腸道菌群的調(diào)控提供潛在靶點以及腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象和數(shù)據(jù)收集

選取2018年11月—2019年7月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科符合條件的121例HCC患者為研究對象。所有患者均自愿參與本研究，并簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準：⑴年齡為18～65歲；⑵ 術(shù)后病理確診為HCC；⑶ 首次進行HCC肝切除術(shù)；⑷ HCC合并乙肝；⑸ 自愿參加本次研究，并簽署知情同意書。排除標準：⑴ 有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤；⑵ HCC破裂急診手術(shù)；⑶ 入院前1個月內(nèi)使用抗生素或益生菌制劑；⑷ 術(shù)前未能收集糞便標本。

所有數(shù)據(jù)均由研究人員收集。除腸道菌群的檢測和焦慮的評估外，其他數(shù)據(jù)均在醫(yī)院系統(tǒng)收集，包括性別；年齡；肝功能指標：總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、Child-Pugh評分、ISHAK炎癥評分、ISHAK纖維化評分；免疫炎性指標：超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive c-reactive protein，hs-CRP）、白細胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細胞計數(shù)（neutrophil，NEU）、淋巴細胞計數(shù)（lymphocyte，LYM）、單核細胞計數(shù)（monocyte，MONO），空腹血糖（fasting blood glucose，GLU）；血脂、肥胖指標：高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol/low-density liporprotein cholesterol，HDL-C/LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol/total cholesterol，HDL-C/T-CHO）、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）；HCC分期：巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinical Liver Cancer，BCLC）分期、中國分期（Chinese Stage，CS）。其中，使用術(shù)前的糞便標本檢測腸道菌群；入院第2天的外周血檢測TBIL、ALB、TBA、AST、ALT、hs-CRP、WBC、NEU、LYM、MONO、GLU、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO；術(shù)后的病理標本評估ISHAK炎癥、纖維化評分。

1.2 腸道菌群失調(diào)診斷

雙歧桿菌/腸桿菌（Bifidobacterium/Enterobacteriaceae，B/E）值＞1表示腸道菌群的組成正常，B/E值＜1表示ID，而且B/E值越低，提示ID越嚴重[12]。

1.3 焦慮評估和糞便標本收集

研究人員使用狀態(tài)焦慮評估量表評估HCC患者術(shù)前的焦慮水平。并在術(shù)前使用糞便標本采集管留取中段糞便作為標本，避免尿液污染，留取標本后放入裝有冰袋的泡沫盒中。研究人員盡快將糞便樣本送往實驗室，分裝成0.2 g/管后放入-80 ℃的冰箱中保存。

1.4 腸道菌群檢測

使用糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（北京天根，DP328-02）提取糞便標本的總DNA，具體步驟嚴格按照說明書進行。本研究使用的引物[13-14]見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。雙歧桿菌（126 bp）正向：5'-GCG TGC TTA ACA CAT GCA AG TC-3'，反向：5'-CAC CCG TTT CCA GGA GCT ATT-3'；腸桿菌（195 bp）正向：5'-CAT TGA CGT TAC CCG CAG AAG AAG C-3'，反向：5'-CTC TAC GAG ACT CAA GCT TGC-3'。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（北京TaKaRa，RR820A）在Applied Biosystems 7500（美國）進行實時熒光定量PCR擴增，擴增的菌群包括雙歧桿菌和腸桿菌。在冰上配置PCR反應(yīng)液，每1份PCR反應(yīng)液 （20 μL）包括TB GreenPremix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL、ROX Reference Dye II 0.4 μL、DNA模板2 μL、滅菌水5.6 μL。擴增程序為：預(yù)變性95 ℃（30 s），變性95 ℃（5 s），退火延伸[雙歧桿菌：60 ℃（34 s），腸桿菌：59 ℃（34 s）]，40個循環(huán)，融解曲線步驟為儀器默認。引物的特異性通過擴增產(chǎn)物的融解曲線來確定。在每1次PCR擴增中均構(gòu)建標準曲線并設(shè)置陰、陽性對照。

1.5 標準曲線構(gòu)建

雙歧桿菌和腸桿菌的質(zhì)粒標準品由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。先檢測標準品的濃度，計算其DNA拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒標準品5倍比8個梯度稀釋后進行實時熒光定量PCR，以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，PCR擴增的結(jié)果CT值為縱坐標來構(gòu)建標準曲線。最后，糞便樣本中雙歧桿菌和腸桿菌的拷貝數(shù)通過其標準曲線來定量。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。采用配對t檢驗比較菌群的豐度。使用Pearson相關(guān)、Spearman秩相關(guān)或兩樣本t檢驗進行單因素分析，然后將單因素分析結(jié)果為P＜0.1的變量納入多重線性回歸（逐步回歸法）。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 標準曲線

雙歧桿菌、腸桿菌質(zhì)粒標準品構(gòu)建的標準曲線的斜率、決定系數(shù)和擴增效率分別為-2.46、0.99、92%和-2.55、0.99、88%，均達到定量的標準（圖1）。

2.2 腸道菌群的定量分析

HCC患者腸桿菌的豐度明顯高于雙歧桿菌[Log5（6.24±1.30）/g vs.Log5（7.59±1.11）/g，P=0.000]。ID（B/E＜1）的發(fā)生率為77.69%（94/121）。

2.3 單因素分析結(jié)果

單因素分析顯示，雙歧桿菌中，性別、TBA、WBC、NEU、MONO、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO的差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對于腸桿菌，TBIL、性別、GLU的差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對于B/E值，MONO差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 質(zhì)粒標準品的標準曲線Figure 1 Standard curves of plasmid DNA standards

表1 單因素分析腸道菌群的影響因素Table 1 Univariate analysis of the influencing factors for gut microbiota

2.4 多重線性回歸分析結(jié)果

多重線性回歸顯示，MONO是雙歧桿菌（P＜0.000）和ID（P=0.008）的主要影響因素；TBIL（P=0.011）、性別（P=0.027）、GLU（P=0.038）是腸桿菌的主要影響因素（表2）。

表2 多重線性回歸分析腸道菌群的影響因素Table 2 Multiple linear regression analysis of the influencing factors for gut microbiota

3 討 論

健康人的腸道菌群主要由專性厭氧有益菌組成，如雙歧桿菌，維持腸道菌群的平衡。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者中雙歧桿菌的豐度顯著低于腸桿菌，與健康人菌群的組成相反，這與之前的報道是一致的[15]。B/E值包括主要的有益菌雙歧桿菌和主要的條件致病菌腸桿菌，構(gòu)成腸道的定植抗性。因此，B/E值可以用來代表ID。B/E＜1表示ID，而且B/E越低，表示ID越嚴重[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，HCC患者ID的發(fā)生率為77.69%。以往研究報道，HCC患者腸道細菌過度生長的發(fā)生率為71.8%，明顯高于肝硬化患者的發(fā)生率（41.1%）[16]。

本研究中，TBIL與腸桿菌呈正相關(guān)，是腸桿菌的主要影響因素之一；MONO與雙歧桿菌和ID呈負相關(guān)，是雙歧桿菌和ID的主要影響因素。其分子機制為:趨化因子CC家族（C-C motif chemokine ligand，CCL）如CCL3、CCL4、CCL5等，由肝腫瘤細胞分泌并參與MONO的激活[17-19]。作為肝功能的重要指標，TBIL升高提示肝功能異常。肝臟功能障礙降低了肝臟清除內(nèi)毒素的能力，其主要活性成分脂多糖進入體循環(huán)。當脂多糖與MONO表面的相應(yīng)受體結(jié)合時，一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的發(fā)生[20-21]。一方面，SIRS導(dǎo)致組織內(nèi)高代謝狀態(tài)，組織內(nèi)氧需求量增加，腸上皮細胞氧分壓降低。另一方面，由于SIRS灌注量低，腎素-血管緊張素的激活引起小動脈收縮，而小腸缺血又進一步加劇了小動脈的收縮[22]。此外，在動物研究中發(fā)現(xiàn)大量的炎癥介質(zhì)使腸道黏膜的通透性增加[23]。腸黏膜屏障因缺氧、缺血和腸黏膜通透性增加遭到破壞，導(dǎo)致腸道菌群的改變。Li等[24]的研究表明，TBIL與內(nèi)毒素呈正相關(guān)，而血漿內(nèi)毒素水平與慢性重型肝炎患者糞腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HCC患者伴隨著雙歧桿菌的減少，腸桿菌的增加，循環(huán)MONO的激活[14]。此外，Chen等[25]的研究證實了腸道菌群與MONO亞群之間的密切聯(lián)系。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究證明了肝功能、炎癥指標與腸道菌群的相關(guān)性，提示肝功能損傷和炎癥的治療有利于促進腸道菌群的平衡，也為腸道菌群干預(yù)作為HCC的治療靶點提供了理論依據(jù)。

性別與腸道菌群具有相關(guān)性，女性和男性的腸道菌群存在明顯的差異[26]。Huang等[27]發(fā)現(xiàn)，兼性厭氧細菌相對豐度的增加和厭氧細菌相對豐度的降低可以作為女性HCC的風險指標，但對于男性HCC無效，因為雌性的腸道菌群比雄性對肝損傷更敏感。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即兼性厭氧菌腸桿菌在女性HCC中比在男性HCC中更為豐富。男性和女性腸道菌群的差異不僅有利于建立不同的HCC預(yù)警模型，也為腸道菌群的調(diào)節(jié)提供了不同的針對性干預(yù)措施。

此外，本研究結(jié)果還提示GLU是HCC患者腸桿菌的主要影響因素之一，兩者呈正相關(guān)。HCC的發(fā)生伴隨著代謝功能的改變，從而引起血糖的改變。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT2直接參與高血糖對腸上皮細胞的轉(zhuǎn)錄重編，改變腸上皮細胞緊密連接和黏附連接的完整性，增加了腸道屏障的通透性，引起腸道菌群的改變[28]。還有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與個體化血糖控制相關(guān)[29]。以往研究[30]和本研究都證實了血糖與腸道菌群的相關(guān)性。這意味著良好的血糖控制有助于個人保持腸道菌群的平衡。

綜上所述，MONO、TBiL、性別和GLU被證實影響HCC患者的腸道菌群，從而導(dǎo)致ID。這些因素與腸道菌群的相關(guān)性可能為HCC患者腸道菌群的調(diào)節(jié)提供潛在靶點，同時也為腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

（本文編輯 姜暉）