陳圣，趙繼森，李靖華，楊季紅，程樹杰

（1.河北大學臨床醫(yī)學院，河北 保定 071000；河北大學附屬醫(yī)院 2.肝膽外科/河北省普通外科數(shù)字醫(yī)學基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 保定 071000）

在全球范圍內(nèi)，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的癌癥之一，在因癌癥死亡原因中占第4位，并且其發(fā)病率預(yù)計將來還會增加[1]。HCC的主要治療手段為肝癌切除術(shù)[2]，而手術(shù)后較高的轉(zhuǎn)移率和復發(fā)率嚴重影響著HCC患者的治療效果和生存期[3-4]。且由于HCC早期無明顯癥狀難以發(fā)現(xiàn)、較早出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等原因?qū)е略S多HCC患者在診斷時已經(jīng)失去了手術(shù)的機會[5]。因此有效的預(yù)后標志模型可能有助于指導個體治療策略的制定從而改善患者生存期。

自噬是溶酶體依賴細胞內(nèi)降解途徑，通過降解不需要的細胞成分在生理、病理生理環(huán)境中對細胞生存、分化、發(fā)育和調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的生理過程[6]。在生理情況下，自噬通過細胞內(nèi)降解機制分解受損的細胞器從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。自噬過程同樣參與許多病理過程，如神經(jīng)退行性疾病，衰老和癌癥[8-9]。越來越多的證據(jù)表明自噬失調(diào)與肝臟疾病如脂肪肝、肝硬化和HCC的發(fā)病機理有關(guān)[10]。近些年，許多研究小組試圖將自噬基因確立為癌癥的潛在治療靶標[11-12]。有研究[13-14]表明自噬藥物可以用作藥理劑，以克服HCC治療中化療的局限性，例如藥物毒性和耐藥性。但這是否是一個替代性的和正在出現(xiàn)的概念仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[15]。以自噬調(diào)節(jié)為視角和潛在治療目標的研究數(shù)目越來越多，自噬可能將成為一種潛在的方法來治療HCC[16]。有研究[17]表明IFN-γ通過誘導自噬體的形成和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3蛋白的轉(zhuǎn)化抑制人HCC細胞生長和非凋亡性細胞死亡。越來越多的研究突顯了自噬在HCC中的重要性，其中確定主要的自噬靶標研究尤為重要。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類無蛋白編碼功能的RNA序列，lncRNA涉及RNA衰變，基因表達的遺傳調(diào)控，RNA剪接，microRNA調(diào)控和蛋白質(zhì)折疊等多種生理過程[18]。其異常表達與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并具有診斷及預(yù)后價值[19]。通過lncRNA-mRNA共表達分析可以較好評估lncRNA的功能[20-21]。在HCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中，發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在扮演著重要作用。有研究[22-23]表明，在HCC中存在lncRNA介導轉(zhuǎn)錄和自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，自噬相關(guān)的lncRNA可能在HCC患者的預(yù)后中具有潛在價值，并且可以作為潛在的治療靶標。本研究旨在建立HCC中自噬相關(guān)的lncRNA預(yù)后模型。

1 材料與方法

1.1 材料

HCC患者轉(zhuǎn)錄組測序及臨床數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)率獲取（https://cancergenome.nih.gov）。下載的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)包含HCC患者374例癌組織以及50例癌旁組織的mRNA和lncRNA表達數(shù)據(jù)。HCC患者的臨床數(shù)據(jù)包括374例HCC的臨床相關(guān)資料，如生存時間、生存狀態(tài)、年齡、性別、腫瘤分級和病理分期等。

1.2 方法

1.2.1 自噬相關(guān)lncRNA 的篩選從HADb 網(wǎng)站（http://autophagy.lu/clustering/index.html）獲 取自噬基因列表。從374 例HCC TCGA RNA 數(shù)據(jù)集中獲得lncRNA 和自噬相關(guān)基因的表達數(shù)據(jù)。利用Pearson 相關(guān)性分析計算lncRNA 與自噬相關(guān)基因的相關(guān)性。滿足|R2|＞0.3 且P＜0.001 的lncRNA 被認為是自噬相關(guān)的lncRNA。

1.2.2 數(shù)據(jù)的預(yù)處理刪除在HCC 患者中生存時間少于30 d 的患者，用于生存分析的數(shù)據(jù)集包括342 例HCC 患者的自噬相關(guān)lncRNA 表達數(shù)據(jù)和臨床資料。利用R 軟件中caret 程序包將用于預(yù)后分析的342 例TCGA 的HCC 數(shù)據(jù)集樣本按70% 與30% 的比例分為訓練集（n=242）和內(nèi)部驗證集（n=100）。

1.2.3 風險預(yù)后模型的構(gòu)建及分析首先，進行單因素Cox 回歸分析及KM 法以評估自噬相關(guān)lncRNA 的預(yù)后價值。篩選出滿足上述2 種方法P 值均＜0.05 與HCC 患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA。使用多因素Cox 回歸分析對具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA 進行篩選并建立風險評分模型。使用風險評分計算公式為每個患者計算風險評分：風險評分=coef基因1×expr基因1+coef基因2×expr基因2+ ...+coef基因?×expr基因?。通過加權(quán)l(xiāng)ncRNA 的表達水平與回歸系數(shù)（coef）得到風險評分。coef值是通過多因素Cox 回歸分析得到的回歸系數(shù)；lncRNA 表達定義為expr 基因n。根據(jù)中位風險評分劃分高風險組和低風險組。利用R 3.6.3 軟件中survival 程序包繪制模型預(yù)后的生存曲線，并比較兩組患者之間生存的差異。繪制預(yù)后模型的ROC曲線以評價模型的靈敏度和特異性。使用R 軟件中survivalROC 程序包繪制ROC 曲線并計算其AUC 數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用Kaplan-Meier法比較高風險組和低風險組的總生存期（OS），采用對數(shù)秩檢驗計算P值。使用單變量和多變量Cox分析來評估風險評分與臨床病理特征或OS之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。自噬相關(guān)lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用Cytoscape軟件（版本3.6.0）完成。

2 結(jié) 果

2.1 自噬基因-lncRNA 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取了TCGA數(shù)據(jù)集中總共 3888個lncRNA。從HADb中總共提取了256個自噬相關(guān)基因。通過構(gòu)建自噬相關(guān)基因-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，鑒定與自噬相關(guān)的lncRNA。最后，347個lncRNA鑒定為自噬相關(guān)lncRNA。

2.2 鑒定HCC 患者的12 種自噬相關(guān)lncRNA 的特征

在242例TCGA訓練集中基于347種自噬相關(guān)的lncRNA使用單因素Cox回歸分析和KM法來篩選具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。同時滿足Kaplan-Meier法及單因素Cox方法P值均＜0.05的lncRNA被考慮為具有預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。共有26個lncRNA對HCC患者具有預(yù)后價值（P＜0.05）。隨后，進一步使用多因素Cox回歸分析對這些lncRNA進行篩選后構(gòu)建預(yù)后模型，同時依據(jù)赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）對模型進行優(yōu)化，最優(yōu)AIC=797.82。最后12個lncRNA被用于構(gòu)建預(yù)后模型（表1）（圖1）。隨后構(gòu)建預(yù)后相關(guān)自噬lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)（圖2）。同時繪制12個自噬相關(guān)lncRNA和自噬相關(guān)基因及對患者總生存期的關(guān)系的組合桑基圖（圖3）。

2.3 自噬相關(guān)的lncRNA 模型對HCC 的預(yù)后影響

使用風險評分公式計算自噬相關(guān)lncRNA模型的風險評分（表2），風險評分公式：風險分數(shù)= coef基因1×expr基因1+coef基因2×expr基因2+...+coef基因?×expr基因?。按中位風險評分值將訓練集HCC患者分為兩組（低風險組和高風險組）。利用R 3.6.3軟件中的survival程序包根據(jù)患者風險評分分析生存差異，繪制風險評分曲線、生存狀態(tài)圖及12個lncRNA表達熱圖（圖4）。隨著風險評分的升高，高風險評分組患者的死亡人數(shù)顯著多于低風險評分組，說明高風險評分組的患者整體生存率較差。風險模型還可以預(yù)測HCC患者的生存時間，其中低風險組的總生存時間比高風險組的總生存時間更長（圖5）。此外，還通過多元Cox回歸分析探討了風險評分簽名是否是HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。在消除了其他因素（如性別，年齡，腫瘤分級和分期）的影響后，該風險評分模型仍可顯著預(yù)測HCC患者的生存（HR=1.201，95% CI=1.141～1.264，P＜0.001）（表3）。隨后，利用survivalROC程序包繪制模型的ROC曲線以評價模型的靈敏度和特異性（1、3和5年AUC分別為0.801，0.819和0.787）（圖6）。

表1 12 個與HCC 預(yù)后有關(guān)自噬相關(guān)lncRNATable 1 The 12 autophagy-related lncRNAs significantly associated with the prognosis of HCC

圖1 HCC 中12 個lncRNA 與自噬基因共表達的網(wǎng)絡(luò)圖（lncRNA 為紅色節(jié)點，自噬基因為藍色節(jié)點）Figure 1 Network of the 12 lncRNAs with the co-expressed autophagy genes in HCC (the red nodes indicating the lncRNAs,the blue nodes indicating the autophagy genes)

圖2 訓練集中12 個lncRNA 的生存曲線圖Figure 2 Survival curves for the 12 prognostic lncRNAs in the train dataset

圖3 12 個lncRNAs 與自噬基因關(guān)系及對HCC 患者預(yù)后的影響Figure 3 The relationship between 12 lncRNAs and autophagy genes and its effect on the prognosis of the HCC patients

表2 訓練集中12 個lncRNA 多因素Cox 回歸分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of the 12 lncRNAs in the train dataset

圖4 訓練集中HCC 患者的自噬相關(guān)lncRNA 風險評分分析Figure 4 Risk score analysis of the autophagy-related lncRNAs in train dataset

圖5 訓練集中不同風險評分HCC 患者的生存曲線Figure 5 Survival curves of the HCC patients with different risk scores in the train dataset

表3 訓練集HCC 患者臨床特征及風險評分的多因素Cox回歸分析Table 3 Multivariate Cox regression analysis of characteristics and risk score of the HCC patients in the train dataset

圖6 訓練集中風險模型的1、3、5年生存的時間依賴性ROC 曲線Figure 6 Time-dependent ROC curves of the risk model for the 1-,3- and 5-year survival in train dataset

2.4 預(yù)后模型與HCC 患者的臨床病理特征的關(guān)系

隨后分析了12-自噬相關(guān)lncRNA風險評分在年齡、性別、分級、分期等方面的臨床價值。結(jié)果顯示，腫瘤分級、腫瘤分期和T分期越高，患者風險評分越高，提示該12-自噬相關(guān)lncRNA模型可能與HCC的進展有關(guān)；而在不同年齡和性別間無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（表4）。

表4 預(yù)后模型風險評分與患者臨床因素的關(guān)系Table 4 The relationship between risk score and clinical factors in patients train dataset

2.5 內(nèi)部驗證集中的驗證

使用相同coef值在內(nèi)部驗證集（n=100）中進一步驗證這些結(jié)果。根據(jù)風險評分的中位值將這些患者分為高風險和低風險組。與從訓練集得出的結(jié)果一致，高風險患者的中位OS比低風險患者的中位OS短（P=0.0236）（圖7）。所構(gòu)建的lncRNA模型在內(nèi)部驗證集中預(yù)測患者1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.694、0.733和0.746（圖8）。

圖7 驗證集中不同風險評分HCC 患者的生存曲線Figure 7 Survival curves of the HCC patients with different risk scores in the validation dataset

圖8 驗證集中預(yù)后模型的1、3、5年生存的時間依賴性ROC 曲線Figure 8 Time-dependent ROC curves of the risk model for the 1-,3- and 5-year survival in the validation dataset

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的成熟，通過檢測lncRNA表達的改變來預(yù)測HCC的預(yù)后的研究也越來，例如UCA1[24]和HOTAIR[25]。已有研究[26]表明可以使用多個自噬相關(guān)lncRNA構(gòu)建模型有效的預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。目前為止，還沒有可以預(yù)測HCC患者生存的自噬相關(guān)lncRNA模型。因此，有必要建立相關(guān)預(yù)后模型來預(yù)測HCC患者的預(yù)后。

在本研究中，通過TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC數(shù)據(jù)集探討HCC患者自噬相關(guān)lncRNA的預(yù)后作用。本研究通過lncRNA-自噬基因共表達網(wǎng)絡(luò)鑒定了347個自噬相關(guān)lncRNA。隨后篩選出12個最具預(yù)后意義的自噬相關(guān)lncRNA。在12種自噬相關(guān)的lncRNA中，CYTOR、DANCR、LINC01138、LUCAT1、MAPKAPK5-AS1、NRAV和NRSN2-AS1的高表達與患者總生存期成負相關(guān)，而LINC01871、LINC00864、LINC02362、TMEM220-AS1 和PSMB8-AS1 的高表達與患者的總生存期成正相關(guān)。在先前的研究中已經(jīng)報道了這些基因中的大多數(shù)在HCC 或其他惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。LINC01138[27-28]在HCC 組織中表達顯著增加，并且與HCC 的臨床病理特征呈正相關(guān)，可能是HCC患者預(yù)后預(yù)測的潛在有價值的候選標志物。DANCR[29]被證明在HCC組織中明顯過表達，并與HCC患者的預(yù)后呈負相關(guān)，且在體外和體內(nèi)促進HCC細胞中索拉非尼的耐藥性。MAPKAPK5-AS1[30]在HCC中與總體存活率顯著相關(guān)，有可能成為HCC的預(yù)后因子。LUCAT1[31]在HCC組織中高表達，且其與患者年齡、腫瘤組織學分級、腫瘤T分期和生存狀態(tài)顯著相關(guān)，是HCC患者生存不良的獨立危險因素。本研究和這些有類似的結(jié)果。

使用12-自噬相關(guān)lncRNA構(gòu)建預(yù)后模型，計算風險評分，分析風險評分與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，在訓練集中風險評分與HCC患者腫瘤分級、腫瘤分期和T分期有關(guān)（P＜0.05），在較高的腫瘤分級、分期中，患者的風險評分趨于增加，表明該lncRNA模型可能與HCC的進展有關(guān)。通過多變量Cox回歸分析，該風險預(yù)后模型是與影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.001）。該風險模型對訓練集HCC患者的1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.801，0.819和0.787，同時在驗證集中同樣具有較好的預(yù)測能力，其1、3、5年生存的時間依賴性ROC曲線的AUC分別為0.694、0.733和0.746。本研究構(gòu)建的自噬lncRNA預(yù)后模型在內(nèi)部驗證集中同樣具有較好的靈敏度和特異性。根據(jù)這些結(jié)果，該12-自噬相關(guān)lncRNA模型為HCC患者的預(yù)后提供可靠的預(yù)測。而且12-自噬相關(guān)lncRNA是潛在的自噬相關(guān)治療靶點，對于個性化治療方案的制定也可能具有參考價值。

本研究仍存在局限性，首先，這是一項回顧性研究，研究數(shù)據(jù)源自于TCGA數(shù)據(jù)庫，因此可能產(chǎn)生一些誤差。其次，該預(yù)后模型仍有必要在其他獨立的隊列中進一步進行驗證，以明確該模型的穩(wěn)定性，對于該模型基因中未被證實功能性實驗證實與HCC預(yù)后相關(guān)的基因需要進一步實驗揭示其潛在作用機制。

通過構(gòu)建自噬基因-lncRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，鑒定了12個自噬相關(guān)的lncRNA的預(yù)測模型，該模型對預(yù)測HCC患者1、3、5年生存率均有較好的靈敏度及特異性。雖然本研究中12-自噬相關(guān)lncRNA風險預(yù)后模型可以較準確的預(yù)測HCC患者的預(yù)后，但仍需要通過前瞻性實驗來進一步驗證。