張 江， 黃邦俊， 李學(xué)莉， 王 旭， 周曉容

（1.安杰利（重慶）生物科技有限公司，重慶榮昌 402460；2.捷力生科（重慶）生物科技有限公司，重慶榮昌 402460；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌 402460）

桿菌七肽又名腺苷七肽（Microcin C7肽），是由乳桿菌、腸桿菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)小分子量的細(xì)菌素類(lèi)抗菌肽，其由7個(gè)氨基酸殘基組成，N端天冬氨酸的羧基與單磷酸腺苷（AMP）通過(guò)N-酰基氨基磷酸酯鍵共價(jià)連接組成的核酸肽。不同微生物分泌的桿菌七肽其氨基酸序列有所差別，但其第一個(gè)氨基酸蛋氨酸和第七個(gè)氨基酸天冬氨酸為其保守序列（Olga 等，2014；Severinov，2012）。桿菌七肽主要抑菌機(jī)理為干擾微生物翻譯蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)抑菌作用 （冉仁森，2017；Metlitskaya等,2006）。桿菌七肽對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌以及某些革蘭氏陽(yáng)性菌均具有很強(qiáng)的殺滅和抑制作用，是潛在的抗生素替代品 （冉仁森，2017）。桿菌七肽可采用化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)。而建立桿菌七肽定量檢測(cè)方法對(duì)于其生產(chǎn)和品控具有重要意義，可以使相關(guān)企業(yè)進(jìn)行質(zhì)量控制，監(jiān)測(cè)產(chǎn)品在生產(chǎn)和使用過(guò)程中的穩(wěn)定性。許多研究表明，細(xì)菌素類(lèi)抗菌肽如NISIN可以采用反向高效液相色譜法測(cè)定，具有快速、簡(jiǎn)單和重復(fù)率高的優(yōu)點(diǎn)（高彩紅等，2011），鑒于桿菌七肽含量的測(cè)定鮮有報(bào)道，本研究目的就是建立一種應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）來(lái)快速定量測(cè)定桿菌七肽的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣品：桿菌七肽純品 （純度99.5%），制備方法參考 Yu等（2017）方法，由國(guó)家飼料工程技術(shù)研究中心西南分中心提供；桿菌七肽噴霧干燥粉，由安杰利（重慶）生物科技有限公司提供，載體為可溶性淀粉，工藝為約氏乳桿菌發(fā)酵、離心、濃縮加入麥芽糊精后進(jìn)行噴霧干燥獲得。

儀器：高效液相色譜儀 （賽默飛Ulti-Mate3000）、C18（4.6 mm×150 mm）反相色譜柱、電子天平（BT2202S）、超純水儀（Milli-Q）、臺(tái)式離心機(jī)、溶劑過(guò)濾器、漩渦混合器（VORTEX 2）、0.22 μm水相濾膜和有機(jī)相濾膜、離心管（2、10 mL）、試管等。

試劑：三氟乙酸TFA（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)）、超純水（Milli-Q）。 流動(dòng)相A（0.1%TFA ）的配制：量取 1000 mL超純水，加入 1 mL TFA，用 0.22 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣10 min；流動(dòng)相B（80%乙腈）：量取 800 mL乙腈，加超純水200 mL，用 0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，超聲脫氣10 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品（標(biāo)準(zhǔn)品）制備 稱取450 mg桿菌七肽純品，定容于100 mL，超聲波振蕩15 min，使其全部溶解，則抗菌肽濃度為4.5 mg/mL。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱量1.00 g樣品于25 mL容量瓶中，加入純水，用超聲處理15 min后定容至25 mL，再次顛倒混勻后取出6 mL于三個(gè)2 mL離心管內(nèi)，8000 r/min離心2 min后用0.22 μm濾膜過(guò)濾，將前約1 mL溶液棄去，后面的溶液接樣檢測(cè)。

1.2.3 高效液相的檢測(cè) 依次開(kāi)啟電腦和高效液相色譜儀各模塊電源，然后打開(kāi)高效液相色譜儀化學(xué)工作站。逆時(shí)針旋開(kāi)液相色譜儀放空閥打開(kāi)旁路，用0.22 μm過(guò)濾的超純水沖洗管路，流速為5 mL/min時(shí)，再用流動(dòng)相A、B充滿管路。接上連接有保護(hù)柱的反相色譜柱，參數(shù)設(shè)為：柱溫：25℃（室溫），檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm（214 nm 為參考波長(zhǎng)），最大壓力：300 bar，流速：1 mL/min，樣品分析洗脫梯度如表1所示。系統(tǒng)平衡至基線水平，檢測(cè)系統(tǒng)適應(yīng)性：取抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解并稀釋成1 mL含抗菌肽0.5 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣3次測(cè)定，峰面積RSD≤2%，表明系統(tǒng)能滿足檢測(cè)要求。

表1 樣品洗脫梯度

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將抗菌肽溶液 （濃度為4.500 mg/mL）按照2倍稀釋，分別得到2.250、1.125、0.563、0.281 mg/mL的溶液，以雙蒸水為對(duì)照，每個(gè)濃度檢測(cè)3次，通過(guò)液相獲得峰面積（峰面積單位用mAU*min表示）。

1.2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 對(duì)照品和不影響其檢測(cè)的可溶性載體（元明粉），制成2%、1%和0.50%桿菌七肽含量的樣品，進(jìn)行3次檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供試品溶液至于室溫條件下，分別于 0、4、8、16、24 h 取 10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，記錄抗菌肽峰面積值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，于同日內(nèi)重復(fù)測(cè)定 6次，計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定 5 d，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回歸曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 在1.2.3的色譜條件下，桿菌七肽對(duì)照品（標(biāo)準(zhǔn)品）的保留時(shí)間為13.9 min（圖1），其桿菌七肽樣品（噴霧干燥粉末）在保留時(shí)間13.9 min處有明顯的峰（圖2），桿菌七肽與相鄰的峰分離度為2.2（大于1.5），而陰性對(duì)照（水）對(duì)應(yīng)保留時(shí)間無(wú)峰面積。

2.2 回歸曲線的繪制 以高效液相色譜獲得的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），上樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）， 得出回歸曲線為 Y=10.353X+0.3806，R2=0.9997（n=6），抗菌肽濃度為 0 ～ 4.5 mg/mL 時(shí)與峰面積的線性關(guān)系良好（圖3）。每個(gè)濃度梯度上樣三次，RSD均小于2%（表2）。

表2 桿菌七肽濃度和相應(yīng)的峰面積

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 表3結(jié)果顯示，抗菌肽含量為0.25%～2.00%時(shí)，其回收率為96.0%～108.0%，表明其回收率較好，誤差較小。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 由表4可知， 經(jīng)過(guò)0、4、8、16、24 h測(cè)定桿菌七肽的含量，峰面積和含量RSD均小于2%，表明其在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

采用反向高效液相色譜法可快速測(cè)定桿菌七肽的含量，其方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好，徐和等（2013）采用C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05%TFA溶液，建立了高效液相色譜法測(cè)定小菜蛾中抗菌肽CA抗菌肽含量的方法；高彩紅等（2011）采用采用C18色譜柱，流動(dòng)相為10%乙腈-90%乙腈，建立了高效液相色譜法測(cè)定乳鏈球菌素含量（效價(jià)）的方法；這些方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高。借鑒之前已發(fā)表的研究結(jié)果，本研究采用C18色譜柱，以80%乙腈 -0.1%TFA為流動(dòng)相，測(cè)定桿菌七肽的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其分離度較好，不受雜峰的影響，可以清晰的辨別目的峰，說(shuō)明此色譜條件是合適的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，桿菌七肽濃度為0～4.5 mg/mL時(shí)線性關(guān)系較好 （R2=0.9997），RSD＜2%。通過(guò)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，其回收率為96%～108%，驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)曲線是正確的，可以用作桿菌七肽含量檢測(cè)。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)室溫下桿菌七肽在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。 桿菌七肽高效液相測(cè)定方法的建立，對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制（QC）和質(zhì)量保證（QA）提供了科研依據(jù)，同時(shí)，為進(jìn)一步研究桿菌七肽在體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定提供了參考方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于桿菌七肽含量的測(cè)定。