齊子鑫， 秦改曉， 王新華， 唐國盤， 郭國軍

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州450046）

酸化劑包括無機酸、有機酸及鹽類，或?qū)⒂袡C酸及其鹽類與無機酸復(fù)合作為復(fù)合酸化劑。酸化劑對魚類的主要作用包括提高飼料的適口性，增加攝食量，降低飼料pH，刺激腸道和肝胰臟分泌更多的消化酶，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進生長（敬婷等，2013； 尚衛(wèi)敏等，2011；Sugiura 等，1998；Balamurali等，1997），抑制腸道有害微生物，促進部分礦物元素吸收，作為營養(yǎng)物質(zhì)直接被機體吸收等（常青，1999）。酸化劑能夠促進消化酶活性的增加，但其添加的最適濃度不同學(xué)者的研究結(jié)果差異較大。這可能與采用的酸化劑種類、添加濃度、魚種類等因素有關(guān)，也與酸化劑在飼料中添加的時間長短及魚類生長階段相關(guān)（尚衛(wèi)敏，2010）。

檸檬酸主要功能表現(xiàn)在促進腸道消化酶分泌，從而促進魚類生長，也可能與腸道有益微生物乳酸菌、酵母菌增長有關(guān)（曹國文等，1992）。乳酸是機體糖酵解的終產(chǎn)物，檸檬酸和乳酸能顯著提高血清中甘油三酯含量以及肝臟6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶活性，表明檸檬酸和乳酸參與機體的脂肪合成代謝（潘慶等，2004）。檸檬酸和磷酸可與礦物元素形成生物學(xué)效價高的絡(luò)合物，提高礦物元素的利用率（常青，1999）。

因此，本文以檸檬酸、乳酸和磷酸配伍，把有機酸中的檸檬酸和乳酸與無機酸結(jié)合組成復(fù)合酸化劑，使不同酸化劑的生理功能互相補充、相互協(xié)同。試驗設(shè)置7個濃度梯度和3個飼喂時間段考查各項生理生化指標(biāo)，研究復(fù)合酸化劑對黃河鯉生長性能、消化酶活性的影響，確定復(fù)合酸化劑在黃河鯉日糧中的適宜添加量和最適飼喂時間，為深入研究酸化劑的作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試驗材料 試驗選用平均體重約（31.12±2.54）g的黃河鯉，由河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站黃河鯉繁育中心提供；參照三種酸化劑最低有效量配制檸檬酸、乳酸、磷酸比例，分別占比60%、20%、20%組成復(fù)合酸化劑，酸化劑（化學(xué)純）由廣東智特奇生物技術(shù)有限公司提供，酶活力測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與分組 試驗在河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院水產(chǎn)試驗室水族館進行。試驗開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)一周，正式試驗時間共56 d。選取21個水族箱，每個水族箱長×寬×高為100 cm×50 cm×70 cm，養(yǎng)殖用水獨立循環(huán)排注。同一酸化劑濃度設(shè)3個重復(fù)，每個水族箱放養(yǎng)黃河鯉30尾。

試驗共設(shè)置7個復(fù)合酸化劑濃度梯度組，基礎(chǔ)飼料中所添加的復(fù)合酸化劑濃度分別為0%（對照組）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，以次粉調(diào)平配比。

1.3 基礎(chǔ)飼料營養(yǎng)與制備 基礎(chǔ)飼料參照鯉營養(yǎng)需要設(shè)計配方，試驗日糧組成及其營養(yǎng)水平見表1。各飼料原料粉碎后，通過孔徑0.425 mm的（40目）篩，充分混合后制成2 mm直徑的顆粒飼料，放置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）%

1.4 飼養(yǎng)管理 每天定時投餌3次，分別為8：00、12：00、17：00，投喂至不搶食為止，記錄每箱飼料投喂數(shù)量。試驗期間每天換水1次，24 h用小型氣泵自動充氣保持溶氧充足；水溫保持在（25±2）℃，pH為8.0～8.5，溶氧5 mg/L以上，氨氮濃度小于0.2 mg/L。觀察記錄試驗魚健康狀況及死亡情況。分別在飼喂20、40、56 d時，各濃度梯度的三個重復(fù)分別隨機抽取5尾魚稱體重，摘取5尾魚的肝胰臟、全腸等組織器官分別放入樣品袋并立即在超低溫冰箱（-80℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能指標(biāo) 記錄每次攝食量 （FI），試驗結(jié)束時，試驗魚禁食24 h后在空腸狀態(tài)下取樣稱量魚體重（W），測定相對增重率（WGR）、特定生長率 （SGR）、 飼料系數(shù) （FCR）、 蛋白質(zhì)效率（PER），計算公式如下：

相對增重率/%=（Wt-W0）/W0×100；

特定生長率/（%/d）=（lnWt-lnW0）×100t-1；

餌料系數(shù)=F/（Wt-W0）；

蛋白質(zhì)效率/%=（Wt-W0）/F×P×100。

式中：W0為試驗開始時魚體重，g；Wt為試驗結(jié)束時魚體重，g；F為飼料攝入量，g；P為飼料中粗蛋白質(zhì)含量，%；t為養(yǎng)殖試驗天數(shù)，d。

1.5.2 粗酶液制備與酶活性測定 采集肝胰臟和全腸進行酶液制備。在投喂餌料后停食12 h，每組取5尾進行肝胰臟和腸道消化酶液采集。在冰盤中解剖取出全腸和肝胰臟，用4℃冷卻的蒸餾水沖洗消化道內(nèi)容物，并用濾紙吸干水分，并按重量體積比 1∶4加入9 mg/mL（0.9%）的生理鹽水，迅速轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，在冰浴環(huán)境中勻漿，將勻漿液置于4℃下冷凍離心15 min后，取上清液即為20%的粗酶液。將粗酶液置于-80℃超低溫冰箱中冷藏保存。

蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性測定參照南京建成生物工程有限公司試劑盒使用說明進行。蛋白酶活性采用福林-酚試劑法（Folin-phenol）測定。1個蛋白酶的比活力單位定義為：pH 7.0，底物酪蛋白質(zhì)量濃度 20 mg/mL，（37±1）℃條件下保溫 10 min，每1 mg酶蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量。淀粉酶活力采用碘-淀粉比色法測定。1個淀粉酶的比活力單位定義為：pH 7.0，（37±1）℃條件下保溫30 min，每毫克酶蛋白中的淀粉酶能完全水解10 mg淀粉時的酶量。1個脂肪酶的比活力單位定義為：pH 7.0，（37±1）℃條件下保溫 10 min，每毫克酶蛋白水解脂肪產(chǎn)生1 μg脂肪酸的酶量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)作單因素方差分析，若組間差異顯著，則做LSD多重比較，顯著水平用P＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度復(fù)合酸化劑對黃河鯉生長性能的影響 由表2可知，隨著復(fù)合酸化劑添加濃度的升高，末體重、相對增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，餌料系數(shù)表現(xiàn)為先降低后上升的趨勢。其中，復(fù)合酸化劑添加濃度為0.6%時生長性能最佳。與對照組（0%）相比，0.6%濃度梯度的個體末體重、相對增重率、餌料系數(shù)、特定生長率、蛋白質(zhì)效率均表現(xiàn)出顯著或極顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；且0.4%與0.6%濃度梯度間的末體重、相對增重率和蛋白質(zhì)效率也表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。

表2 復(fù)合酸化劑對黃河鯉生長性能的影響

2.2 不同濃度復(fù)合酸化劑對黃河鯉消化酶活性的影響

2.2.1 不同濃度復(fù)合酸化劑對黃河鯉腸道消化酶活性的影響 與對照組相比，隨復(fù)合酸化劑在日糧中添加濃度升高，各組腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，0.6%濃度梯度酶活最高（圖 1-A、1-B、1-C）。其中0.2%和0.4%組腸蛋白酶活性較對照組比差異不顯著，其他組與對照組比均差異顯著，且與0.2%組差異顯著；0.4%和0.6%組腸道淀粉酶活性與對照組比差異顯著（P＜0.05），其他各組差異不顯著；腸道脂肪酶活性各組間差異不顯著。

2.2.2 不同濃度復(fù)合酸化劑對黃河鯉肝胰臟消化酶活性的影響 與對照組相比，隨復(fù)合酸化劑在日糧中添加濃度升高，肝胰臟蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中，肝胰臟蛋白酶活性，0.2%～0.4%組呈升高趨勢，0.4%組酶活最高，0.4%～1.2%組呈下降趨勢，各組間差異不顯著（圖1-D）。肝胰臟淀粉酶活性和脂肪酶活性也表現(xiàn)出相似的變化趨勢，0.2%～0.6%組表現(xiàn)為升高趨勢，0.6%～1.2%組表現(xiàn)為下降趨勢，0.6%組表現(xiàn)最佳，各組間差異不顯著（圖1-E、1-F）。

2.3 特定飼喂時間復(fù)合酸化劑對黃河鯉消化酶活性的影響

2.3.1 特定飼喂時間復(fù)合酸化劑對黃河鯉腸道消化酶活性的影響 隨飼喂時間的延長，與對照組相比，復(fù)合酸化劑組腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性皆有提高。各酸化劑濃度梯度的腸道消化酶活性在飼喂20～40 d呈上升趨勢，40～56 d呈下降趨勢（圖2-A、2-C、2-B），其中腸道蛋白酶活性在低于0.6%濃度組自20～56 d皆呈升高趨勢，但高于0.6%濃度組40～56 d呈下降趨勢（圖2-A）。以0.6%濃度組飼喂56 d時腸蛋白酶酶活性最高。腸道脂肪酶活性以0.2%～0.4%酸化劑濃度組飼喂至40～56 d時表現(xiàn)為升高趨勢，0.6%～1.2%酸化劑濃度組呈先升高后下降趨勢，以0.6%酸化劑濃度飼喂40 d時活性最高。各酸化劑濃度梯度的腸道消化酶活性在三個測定時間點之間差異均不顯著。

2.3.2 特定飼喂時間復(fù)合酸化劑對黃河鯉肝胰臟消化酶活性的影響 隨復(fù)合酸化劑飼喂時間延長，與對照組相比，復(fù)合酸化劑組肝胰臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性皆有提高，其中0.2%～0.8%濃度組肝胰臟蛋白酶活性，0.2%～0.6%濃度組肝胰臟淀粉酶活性和脂肪酶活性變化趨勢一致，飼喂至20～40 d時呈升高趨勢，40～56 d時呈下降趨勢（圖2-D、2-E、2-F）。 但 1.2%濃度組肝胰臟蛋白酶活性表現(xiàn)為下降。各濃度組在不同檢測時間段之間差異不顯著。

3 討論

3.1 復(fù)合酸化劑對黃河鯉生長性能的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，黃河鯉末體重、相對增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率等生長指標(biāo)隨著復(fù)合酸化劑添加濃度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，餌料系數(shù)表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，其中以0.6%添加濃度的生長性能指標(biāo)最優(yōu)。本文研究結(jié)果與周克勇等（2006）在鯉飼料中添加0.64%濃度的復(fù)合酸化劑效果最佳和敬婷等（2013）在湘云鯽日糧中添加4 g/kg濃度的L-蘋果酸生長最佳的結(jié)果基本一致，但與冷向軍等（2001）在異育銀鯽中添加0.2%～0.3%濃度檸檬酸效果最佳的結(jié)果有所不同。不同研究結(jié)果可能與復(fù)合酸和單一酸生理表觀效果不同有關(guān)，也可能與試驗魚種類不同有關(guān)。

3.2 復(fù)合酸化劑對黃河鯉腸道和肝胰臟消化酶活性的影響 本試驗結(jié)果表明，添加復(fù)合酸化劑可以明顯促進蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，低于0.6%濃度組消化酶活性表現(xiàn)逐漸升高，高于0.6%組表現(xiàn)為逐漸降低或抑制趨勢。各濃度組的腸道消化酶活性和肝胰臟消化酶活性隨飼喂時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其原因可能是過量的酸進入腸道后，超出了機體調(diào)節(jié)能力，破壞了腸道環(huán)境，抑制腸絨毛的生長，對魚類的消化道黏膜組織造成損傷，使魚體處于應(yīng)激狀態(tài)，反而抑制消化酶活性；也可能與破壞消化道黏膜上皮細胞的腺體細胞的完整性，從而抑制了蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的分泌，影響機體的正常生理功能的發(fā)揮有關(guān)（李赟等，2014）。也有研究表明，黃河鯉腸道淀粉酶最適pH為6.5～7.0，腸道脂肪酶最適值為pH為 7.0～7.5（倪壽文等，1992），酸化劑的添加濃度過高或時間過長均會改變黃河鯉腸道和肝胰臟消化酶活性的最適pH范圍。

本研究得到的消化酶活性變化趨勢與尚衛(wèi)敏（2010）和李赟等（2014）的研究結(jié)果類似。 低于0.6%濃度組消化酶活性變化趨勢的研究結(jié)果，與潘慶等（2004）添加檸檬酸和乳酸可顯著提高羅非魚腸蛋白酶活性，王紀(jì)亭等（2009）添加復(fù)合酸使消化酶活性隨添加濃度提高而升高的趨勢結(jié)果相類似。但潘慶等（2004）采用的羅非魚屬有胃魚類，酸化劑對蛋白酶的影響趨勢更加顯著。而本試驗選擇的研究對象為黃河鯉幼魚，其腸道和肝胰臟消化酶分泌機制尚不完善；復(fù)合酸化劑對腸道淀粉酶活性未表現(xiàn)出顯著影響，可能與無胃魚對淀粉的利用率不高的生理特點有關(guān)（魏清和，2004）。復(fù)合酸化劑對肝胰臟脂肪酶的影響在0.4%和0.6%組差異顯著，表明酸化劑對肝胰臟脂肪酶的影響較為明顯，可能與無胃魚對脂肪有較高的利用率有關(guān)（魏清和，2004）。

4 結(jié)論

在黃河鯉日糧中添加復(fù)合酸化劑可提高黃河鯉生長性能，且復(fù)合酸化劑可提高黃河鯉腸道消化酶和肝胰臟消化酶活性，表現(xiàn)為隨添加濃度升高消化酶活性呈先升高后下降的變化趨勢，飼喂時間40～56 d消化酶活性呈下降趨勢，表明添加過高濃度復(fù)合酸化劑和超過40 d飼喂時間可抑制消化酶活性。因此，復(fù)合酸化劑在黃河鯉日糧中最佳添加濃度為0.4%～0.6%，適宜短時間階段性飼喂。