石華盛 辛洋 韓冰 吳力群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 肝臟病中心； 2 肝膽胰外科)

肝細(xì)胞癌(HCC)仍是目前全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例和死亡病例均超過(guò)80萬(wàn)例，而我國(guó)患者的占比超過(guò)50%[1]。盡管近年來(lái)對(duì)HCC的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，但HCC發(fā)生的確切分子機(jī)制仍不是很清楚。同時(shí)由于治療策略的局限性，全世界的HCC病死率依舊很高，因此，迫切需要了解HCC發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制。近年來(lái)，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和逐漸成熟，微陣列和高通量測(cè)序技術(shù)在探索腫瘤診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用[2]，如影響胃癌預(yù)后的關(guān)鍵基因就首先通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測(cè)并最后證實(shí)的[3]。因此通過(guò)對(duì)HCC的基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析可有效幫助了解腫瘤形成的分子機(jī)制，甚至可以找到潛在的治療新靶點(diǎn)。本研究首先利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選人類HCC組織和正常肝組織樣本中差異表達(dá)的基因，再對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能富集分析，探究其主要參與調(diào)控的生物學(xué)功能，并通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)和生存分析，挖掘HCC發(fā)病和預(yù)后的潛在關(guān)鍵基因。

1 資料與方法

1.1 通過(guò)GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選HCC組織與正常肝組織差異表達(dá)基因

首先通過(guò)Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)當(dāng)中的8個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE19665、GSE84402、GSE60502、GSE45267、GSE64041、GSE39791、GSE76427以及GSE36376)和The Cancer Genome Atlas(TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載所有HCC基因的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，再應(yīng)用R軟件中的Limma軟件包[4]對(duì)原始RNA測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行差異分析，篩選出HCC組織與正常肝組織差異表達(dá)的基因。再使用R包“RobustRankAggreg”[5]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行交叉整合，以|log2FC|≥1和P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析

利用在線網(wǎng)站DAVID 6.8分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)上面篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并進(jìn)一步應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[7]進(jìn)行PPI分析，將置信度得分設(shè)為0.9，構(gòu)建得到的PPI網(wǎng)絡(luò)再進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape[8]，然后應(yīng)用Cyto-Hubba插件中的Degree算法[9]進(jìn)行分析，確定其中與發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.3 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組HCC患者生存分析

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(包含有364例HCC患者的臨床信息)獲取HCC患者的總體生存時(shí)間(OS)(去除OS為0的患者)，結(jié)合篩選出的HCC組織與正常肝組織差異表達(dá)基因，采用單因素Cox分析篩選出與HCC患者預(yù)后相關(guān)的基因。進(jìn)一步將其中P<0.000 1與預(yù)后相關(guān)的基因再進(jìn)行多因素Cox回歸分析，根據(jù)基因表達(dá)值的線性組合構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后。計(jì)算公式為：預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=基因1的表達(dá)值×基因1的β1系數(shù)+基因2的表達(dá)值×基因β2系數(shù)+...基因n的表達(dá)值×基因n的βn系數(shù)[10]。根據(jù)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將HCC患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線比較兩組患者的預(yù)后，使用R包“SurvivalROC”構(gòu)建HCC患者ROC生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織和正常組織差異表達(dá)的基因

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的8個(gè)數(shù)據(jù)集中下載HCC患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)后，通過(guò)R軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和差異分析，共篩選出452個(gè)HCC組織和正常組織差異表達(dá)的基因，包括242個(gè)下調(diào)基因和210個(gè)上調(diào)基因，同樣的方法從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出8 938個(gè)差異表達(dá)基因，包含1 546個(gè)下調(diào)基因和7 392個(gè)上調(diào)基因；對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的差異表達(dá)基因使用R包交叉整合后，得到差異表達(dá)的基因400個(gè)，包括219個(gè)下調(diào)基因和181個(gè)上調(diào)基因。

2.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析結(jié)果

對(duì)400個(gè)HCC組織和正常組織差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能富集分析，顯示這些基因主要參與細(xì)胞分裂過(guò)程，排列在前10位的功能分別為細(xì)胞器裂變、核分裂、有絲分裂核分裂、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、染色體分離、有機(jī)酸分解過(guò)程、羧酸分解過(guò)程、細(xì)胞對(duì)異生素刺激的反應(yīng)、姐妹染色體分離、有絲分裂姐妹染色體分離；KEGG通路富集分析顯示，400個(gè)差異表達(dá)的基因主要參與了與腫瘤代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的途徑，參與的前10個(gè)主要通路分別是細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、視黃醇代謝、化學(xué)致癌作用、細(xì)胞色素P450對(duì)生物素的代謝、酪氨酸代謝、色氨酸代謝、脂肪酸降解、P53信號(hào)通路。

2.3 PPI分析篩選出差異表達(dá)的關(guān)鍵基因

對(duì)400個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI分析，根據(jù)Degree算法進(jìn)行排序顯示，排名前10位差異表達(dá)基因分別為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(TOP2A)、細(xì)胞分裂周期蛋白20(CDC20)、細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)、細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)、核分裂周期蛋白80(NDC80)、細(xì)胞周期蛋白B2(CCNB2)、有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(MAD2L1)、驅(qū)動(dòng)蛋白超家族蛋白11(KIF11)、紡錘體檢測(cè)蛋白(BUB1B)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1(CDK1)，即為HCC組織和正常組織差異表達(dá)的關(guān)鍵基因(圖1)。

圖1 HCC組織和正常組織差異表達(dá)基因的PPI分析圖

2.4 HCC患者的生存分析

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的HCC患者OS以及400個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行單因素Cox分析，總共篩選出與HCC患者預(yù)后相關(guān)的基因119個(gè)，其中P<0.000 1與預(yù)后相關(guān)基因40個(gè)，對(duì)40個(gè)基因再進(jìn)行多因素回歸分析，構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型中顯示，醇脫氫酶4(ADH4)、組蛋白賴氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)、剪接因子3B第4亞單位(SF3B4)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)、血清對(duì)氧磷酶-1(PON1)、亞甲胺轉(zhuǎn)移酶-環(huán)化脫氨酶(FTCD)、透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)因子受體(HMMR)、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α2(KPNA2)、母系胚胎亮氨酸拉鏈蛋白激酶(MELK)、細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子2(SOCS2)、分泌磷蛋白1(SPP1)以及甲狀腺激素受體因子13(TRIP13)共12個(gè)基因與預(yù)后密切相關(guān)。所有患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分見(jiàn)圖2A，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值為0.990，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分>0.990的患者182例作為高風(fēng)險(xiǎn)組，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分≤0.990的患者182例作為低風(fēng)險(xiǎn)組，圖2A中紅色代表高風(fēng)險(xiǎn)組，綠色代表低風(fēng)險(xiǎn)組；HCC患者的生存狀態(tài)分布圖見(jiàn)圖2B，顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的死亡數(shù)量顯著多于低風(fēng)險(xiǎn)組，圖中紅色圓點(diǎn)代表死亡患者，綠色圓點(diǎn)代表存活的患者。Kaplan-Meier曲線顯示，兩組患者的OS存在顯著差異(圖3A)，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后顯著好于高風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.000 1)；低風(fēng)險(xiǎn)組患者1、3、5年總體生存率分別為95.37%(95%CI=92.29%～98.56%)、8.75%(95%CI=71.06%～87.26%)及68.16%(95%CI=58.33%～79.66%)；高風(fēng)險(xiǎn)組1、3及5年的總體生存率分別為70.41%(95%CI=63.81%～77.66%)、45.80%(95%CI=37.72%～55.61%)、28.78%(95%CI=20.00%～41.44%)。ROC生存曲線顯示，HCC患者1、3、5年OS對(duì)應(yīng)的AUC值分別為0.816、0.746和0.728(圖3B)。

A：低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組患者的Kaplan-Meier曲線；B：HCC患者1、3和5年生存ROC曲線

A：HCC患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布圖；B：HCC患者的生存狀態(tài)分布圖

3 討 論

通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析篩選腫瘤組織與正常組織差異表達(dá)的基因，并進(jìn)一步進(jìn)行PPI分析和生存分析，挖掘與腫瘤的診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供研究思路和方向，是目前新興的一種行之有效的研究方法。

本研究首先對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的8個(gè)數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，篩選出HCC組織和正常組織差異表達(dá)的400個(gè)基因，包括219個(gè)下調(diào)基因和181個(gè)上調(diào)基因；GO功能富集顯示，這些差異表達(dá)基因主要涉及有絲分裂、核分裂、染色體分離等功能。KEGG通路富集分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要參與調(diào)控細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等通路。提示HCC的發(fā)生發(fā)展可能與調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期的基因有關(guān)，或是與相關(guān)通路的激活等有關(guān)。通過(guò)對(duì)400個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行PPI分析，發(fā)現(xiàn)了與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因10個(gè)，即CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB2、CCNB1、MAD2L1、KIF11、BUB1B、TOP2A和NDC80，主要參與了細(xì)胞的有絲分裂。CDK1編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1，是CDK家族中細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)激酶。相關(guān)研究表明CDK1的過(guò)表達(dá)與HCC的門(mén)脈侵襲、高甲胎蛋白水平以及預(yù)后不良具有直接關(guān)系[11]。

通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者的OS進(jìn)行單因素Cox分析和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，發(fā)現(xiàn)與HCC預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因12個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，ADH4作為ADH家族的關(guān)鍵成員，其mRNA和蛋白的表達(dá)水平在HCC組織中均顯著降低，與HCC患者的預(yù)后顯著相關(guān)[12-13]；ALDH2異常表達(dá)在許多疾病的發(fā)病過(guò)程當(dāng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]；EZH2可通過(guò)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)和下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[14]，已經(jīng)證明其過(guò)表達(dá)可與HCC的惡性進(jìn)展和侵襲性表型密切相關(guān)[15]；FTCD存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并且在肝臟的含量最高[16-17]，已經(jīng)被確定為原發(fā)性HCC的一種新型腫瘤標(biāo)志物,在組織中的表達(dá)下調(diào)是HCC發(fā)生因素之一[18]；HMMR最初被確定為透明質(zhì)酸的受體，同時(shí)，HMMR是一種致癌蛋白[19]；KPNA2是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的七個(gè)成員之一[20]，在細(xì)胞的核質(zhì)運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用，其表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)[21]；MELK是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶，在HCC組織中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致HCC早期復(fù)發(fā)和不良預(yù)后[22]；PON1屬于鈣依賴性水解酶家族，血清中PON1的低表達(dá)總是與HCC中微血管侵犯相關(guān)[23]，但目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)PON1在HCC預(yù)后中的具體機(jī)制；SF3B4是剪接因子3b復(fù)合體的組成部分之一[24]，其在HCC中高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致HCC的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后[25-26]；SOCS2屬于細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)家族的蛋白質(zhì)抑制因子，SOCS2低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的侵襲性增加，并且SOCS2低表達(dá)往往造成HCC的不良預(yù)后[27]；SPP1是在各種組織細(xì)胞中均表達(dá)的多功能細(xì)胞因子[28]，目前認(rèn)為是HCC早期復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的潛在標(biāo)志物[29]；TRIP13蛋白可與甲狀腺激素受體相互作用[30]，主要參與細(xì)胞的分裂以及DNA的修復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)TRIP13的高表達(dá)與包括HCC在內(nèi)的各種癌癥患者較差的預(yù)后有關(guān)[31]。

本研究針對(duì)與HCC預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，生存分析結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后存在顯著差異；低風(fēng)險(xiǎn)組患者1、3和5年總體生存率比高風(fēng)險(xiǎn)組高，提示低風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后好于高風(fēng)險(xiǎn)組；構(gòu)建的ROC曲線中HCC患者1、3和5年OS對(duì)應(yīng)的AUC值分別為0.816、0.746和0.728，表明本研究所構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)效果較好。

本研究通過(guò)針對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中篩選出與HCC發(fā)病機(jī)制和預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，預(yù)測(cè)了這些關(guān)鍵基因可能參與的生物學(xué)途徑和功能，并通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)這些關(guān)鍵基因進(jìn)行了預(yù)后分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選出的關(guān)鍵基因與預(yù)后具有相關(guān)性。本研究中篩選出的與HCC發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)的基因，可能是HCC治療的潛在靶點(diǎn)，但具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。