席躍 吳澤華 徐文迪 武杰 孫傳東

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，山東 青島 266003)

肝癌的發(fā)病率在我國(guó)高居第4位，病死率是所有癌癥相關(guān)死亡的第5位,其中肝細(xì)胞癌(HCC)在所有肝癌中的構(gòu)成比為75%～85%[1-2]。盡管近幾年來(lái)臨床影像診斷技術(shù)、外科手術(shù)方法及介入技術(shù)、藥物靶向治療等已經(jīng)取得了突破性的發(fā)展，但晚期HCC患者的占比仍然較多，總體預(yù)后很差。因此，關(guān)于HCC發(fā)展的具體分子機(jī)制的研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(CeRNA)學(xué)說(shuō)最早由SALMENA等[3]提出，該學(xué)說(shuō)指出lncRNA或mRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合不少于1個(gè)miRNA，形成miRNA應(yīng)答原件(MRE)和lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)調(diào)控mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)體內(nèi)的蛋白水平。研究表明，每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，并且每個(gè)mRNA都包含了不同的MRE，因此又可以被多個(gè)miRNA靶向調(diào)節(jié)[4-5]。最近，越來(lái)越多的研究證實(shí)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在多種腫瘤的發(fā)展機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[6-8]，如lncRNA HULC可以通過(guò)與miR-372競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合影響PRKACB基因表達(dá)[9]，lncRNA MCM3AP-AS1可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-194-5p影響FOXA1的表達(dá)[10]，從而促進(jìn)HCC的發(fā)展。外泌體是細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜與多囊泡體(MVBs)融合而釋放的小囊泡，可在細(xì)胞之間運(yùn)輸生物活性分子[8]，通過(guò)多種生物分子(DNA、RNA或蛋白質(zhì))調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及細(xì)胞微環(huán)境[9-10]，并參與調(diào)節(jié)多種與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。因此腫瘤來(lái)源的外泌體包含大量與腫瘤相關(guān)的血清學(xué)標(biāo)志物，可用于多種腫瘤如早期肝癌的檢測(cè)[13-15]。本研究基于生物信息學(xué)方法，從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO、TCGA、exoRBase數(shù)據(jù)庫(kù))中分析篩選出HCC癌組織與正常組織以及HCC患者血液與健康人血液中差異表達(dá)的外泌體基因，再篩選出與HCC預(yù)后關(guān)系密切的關(guān)鍵基因，并對(duì)這些關(guān)鍵基因通過(guò)CeRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)調(diào)控關(guān)系，探討HCC發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)的外泌體基因的篩選

分別在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中的GSE10143、GSE17856、GSE54236 3個(gè)數(shù)據(jù)集以及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(portal.gdc.cancer.gov)、exoRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(www.exorbase.org/exoRBase)中檢索HCC癌組織與正常組織以及HCC患者血液與健康人血液當(dāng)中均差異表達(dá)的外泌體基因，應(yīng)用limma R及SVA R包對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行矯正處理及差異分析，以|log2FC|>1及P<0.05作為篩選差異基因的過(guò)濾條件，篩選出HCC癌組織和正常組織以及HCC患者血液和健康人血液中的差異表達(dá)的基因，即lncRNA、miRNA及mRNA。取交集后得到在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均存在的外泌體差異表達(dá)基因；利用Upset R包對(duì)交集中差異表達(dá)的基因進(jìn)行可視化分析。

1.2 與預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選及可視化分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取HCC患者的生存信息，利用Survival R包對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均差異表達(dá)的基因進(jìn)行合并和生存分析，篩選出與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)與mRNA結(jié)合的miRNA，及通過(guò)miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)(www.mircode.org/)預(yù)測(cè)與lncRNA結(jié)合的miRNA。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的關(guān)鍵基因，最后篩選出與預(yù)后密切相關(guān)的外泌體關(guān)鍵基因。隨后利用Cytoscape軟件對(duì)上述得到的外泌體關(guān)鍵基因構(gòu)建CeRNA網(wǎng)絡(luò)，可視化lncRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控關(guān)系。

1.3 外泌體關(guān)鍵基因的功能富集分析

參考CeRNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，應(yīng)用GSEA軟件對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行功能富集分析。選擇c5.bp.v7.1.symbols.gm作為參考基因集，截?cái)嘀?Cut-off)為：基因大小≥100，|富集分?jǐn)?shù)(ES)|>0.6和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的差異表達(dá)的外泌體基因

自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE17856數(shù)據(jù)集中篩選出HCC癌組織與正常組織及HCC患者血液與健康人血液中均差異表達(dá)的外泌體mRNA 869個(gè)，lncRNA 268個(gè)，GSE10143數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)的mRNA 1 210個(gè)，lncRNA 134個(gè)，GSE54236數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)的mRNA 344個(gè)，lncRNA 78個(gè)；自TCGA數(shù)據(jù)中篩選出差異表達(dá)的mRNA 527個(gè)，lncRNA 168個(gè)，miRNA 274個(gè)；自exoRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出差異表達(dá)的mRNA 151個(gè)，lncRNA 60個(gè)。對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交集后共得到HCC患者癌組織和血液中均差異表達(dá)的外泌體mRNA 38個(gè)，lncRNA 23個(gè)，miRNA 274個(gè)。利用Upset R包對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)交集中差異表達(dá)的基因進(jìn)行可視化分析，圖中各柱形的高度及數(shù)量反應(yīng)了各數(shù)據(jù)庫(kù)中均差異表達(dá)的外泌體基因情況(圖1)。

A、B、C分別為3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均差異表達(dá)的外泌體lncRNA、mRNA及miRNA

2.2 差異表達(dá)的外泌體基因的預(yù)后分析結(jié)果

利用Survival R包將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均差異表達(dá)的外泌體基因與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者的生存信息進(jìn)行合并和生存分析后，共篩選得到與預(yù)后相關(guān)的外泌體關(guān)鍵基因lncRNA 1個(gè)，miRNA 28個(gè)，mRNA 9個(gè)。通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)和miRcode數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與lncRNA和mRNA共結(jié)合的miRNA和mRNA，發(fā)現(xiàn)符合條件的基因有hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-613、PTMA、CDC42、HNRNPA3、STK4。結(jié)合上面篩選出的與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因結(jié)果，最后確定與預(yù)后密切相關(guān)的8個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)閘ncRNA GTF2IRD2P1、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-613、HNRNPA3、CDC42、PTMA、STK4。隨后使用Cytoscape軟件構(gòu)建8個(gè)關(guān)鍵基因CeRNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，圖中清晰顯示出lncRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控關(guān)系，即hsa-miR-613可分別競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合lncRNA GTF2IRD2P1、CDC42、PTMA、HNRNPA3；hsa-miR-206可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合lncRNA GTF2IRD2P1、CDC42、PTMA與HNRNPA3；hsa-miR-23b-3p可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合lncRNA GTF2IRD2P1與STK4(圖2)，其中紅色節(jié)點(diǎn)為lncRNA，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為miRNA，綠色節(jié)點(diǎn)為mRNA，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示兩者之間存在相互作用關(guān)系。

圖2 關(guān)鍵基因的CeRNA調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 關(guān)鍵基因的功能富集分析結(jié)果

通過(guò)GSEA軟件對(duì)外泌體關(guān)鍵基因功能富集分析，結(jié)果顯示這些關(guān)鍵基因主要與“器官或組織特異性免疫應(yīng)答”和“囊泡內(nèi)吞過(guò)程”功能相關(guān)(圖3)，其中GO_ORGAN_OR_TISSUE_SPECIFIC_IMMUNE_RESPONSE中ES值為0.73，NES為2.04，P值為0.001；GO_ENDOCYTIC_VESICLE_LUMEN中ES值為0.65，NES為1.91，P值為0.001。

A：器官或組織特異性免疫應(yīng)答功能；B：囊泡內(nèi)吞過(guò)程

3 討 論

全世界范圍內(nèi)每年約有782 500例新發(fā)HCC患者，HCC居癌癥死亡原因的第2位[12]。盡管目前HCC的治療方法已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但因多數(shù)HCC患者發(fā)現(xiàn)較晚，總體預(yù)后仍然不令人滿意[13-15]。越來(lái)越多研究表明，非編碼RNA參與了轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳等的調(diào)控，參與多種疾病的發(fā)展過(guò)程[16-18]，許多非編碼RNA也是腫瘤密切相關(guān)的預(yù)后標(biāo)志物。ROBINSON等[19]首次應(yīng)用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)構(gòu)建了腸上皮細(xì)胞通路的miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，對(duì)腸上皮細(xì)胞CeRNA調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了很好解釋，通過(guò)鑒定CeRNA網(wǎng)絡(luò)中的子網(wǎng)絡(luò)(sub-network)，挖掘出大量與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，如cyclinD和c-MYC。因此，應(yīng)用生物信息學(xué)方法結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中基因信息，探索腫瘤發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，可為惡性腫瘤的診斷和治療提供新的研究方向[20-21]。

目前關(guān)于HCC患者預(yù)后的CeRNA調(diào)控機(jī)制研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GTF2IRD2P1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和正常組織中表達(dá)存在差異，并與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)[22]。因此推測(cè)lncRNA GTF2IRD2P1可能通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，對(duì)HCC的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常人，miR-23b-3p在HCC患者的血清中表達(dá)下調(diào)，因此可以作為HCC診斷的血清標(biāo)志物[23-24]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-613可通過(guò)與SOX9基因結(jié)合發(fā)揮抑制HCC發(fā)展的作用[25]，miR-206通過(guò)下調(diào)PTP1B基因抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[26]，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究明確。作為CeRNA中下游分子，已經(jīng)有研究證明CDC42在HCC癌組織中表達(dá)升高，并且可以通過(guò)JNK通路，影響HCC細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移[27]。此外，STK4通過(guò)與lncRNA H19競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-15b，促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[28]。PTMA可通過(guò)TLR通路，影響慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HCC的進(jìn)展[29]。本研究基于生物信息學(xué)方法篩選和確定了與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)的8個(gè)外泌體關(guān)鍵基因，即lncRNA GTF2IRD2P1、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-613、PTMA、CDC42、HNRNPA3以及STK4，并通過(guò)構(gòu)建CeRNA網(wǎng)絡(luò)，揭示了關(guān)鍵基因之間的相互作用的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)lncRNA GTF2IRD2P1可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-23b-3p、miR-613和miR-206，達(dá)到抑制PTMA、CDC42、HNRNPA3、STK4基因表達(dá)的作用，從而從分子水平揭示了HCC的發(fā)展機(jī)制。同時(shí)利用GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵基因主要與“囊泡內(nèi)吞過(guò)程”和“器官或組織特異性免疫應(yīng)答”功能相關(guān)，為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的思路和方向。

但CeRNA網(wǎng)絡(luò)也有其一定的局限性，其只能揭示出相互之間可能具有一定的調(diào)控關(guān)系，而不能明確具體的調(diào)控機(jī)制以及之間的變化關(guān)系，需要通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。