陶玉冰 趙世華 王斐

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科,山東 青島 266071)

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升，已成為最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2],其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)作為其最常見的病理類型，近年來發(fā)病率不斷增高[2-3]。而非髓性甲狀腺癌(NMTC)占甲狀腺癌的95%以上，5%～10%的NMTC患者具有家族史[4]，因此關(guān)于該病家族性遺傳的研究逐漸引起重視。其中家族性NMTC(FNMTC)僅占NMTC的3%～10%，但其遺傳傾向性在所有類型甲狀腺癌中是最高的[5]，其中家族性甲狀腺乳頭狀癌(FPTC)在FNMTC中占比最多，約占90%，其余為濾泡型甲狀腺癌(包括Hurthle細(xì)胞型)[6]。對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)暫未形成統(tǒng)一定論，考慮遺傳基因突變可能是FNMTC患者主要致病因素。近年來，已發(fā)現(xiàn)了多種可能的致病易感基因，期望通過功能分析進(jìn)一步明確這些基因生物學(xué)功能，揭示FNMTC發(fā)病的分子機(jī)制[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白2(HABP2)基因G534E位點(diǎn)突變與FNMTC的發(fā)病可能存在一定關(guān)系[8-9]，但隨后不同國家的相關(guān)研究結(jié)果并不一致。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)HABP2 基因G534E位點(diǎn)突變與FNMTC的易感性無關(guān)[10-14]，可能不同地區(qū)和種族該病的易感基因并不相同。同時(shí)我國國內(nèi)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道很少，因此本研究通過對(duì)我國4個(gè)FPTC家系先證者及其家族成員的相關(guān)臨床資料進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)HABP2基因G534E位點(diǎn)的突變與我國FPTC發(fā)病的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取的我國4個(gè)FPTC家系先證者及其家族成員均不存在甲狀腺疾病致病因素暴露史，4個(gè)家系的系譜如下：1號(hào)家系(圖1A)先證者(1代患者1)是女性患者，其2個(gè)女兒(2代患者1、2)及兒子(2代患者3)均為PTC患者，其丈夫患有多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。2號(hào)家系(圖1B)姐姐為先證者(2代患者1)，其中1妹妹為PTC患者(2代患者2)，另1妹妹有多發(fā)性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，其父母已故，生前無甲狀腺相關(guān)疾病史，其弟弟經(jīng)超聲篩查正常。3號(hào)家系(圖1C)母親為先證者(1代患者1)，其2個(gè)女兒為PTC患者(2代患者5及2代患者6)，另1個(gè)女兒(2代患者3)患有多發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，先證者的丈夫與2個(gè)女兒及1個(gè)孫子經(jīng)甲狀腺超聲篩查均正常，女婿未采血樣送檢。4號(hào)家系(圖1D)先證者(2代患者1)為第2代PTC女性患者，其母親和弟弟分別患有甲狀腺功能減退癥和甲狀腺功能亢進(jìn)癥，但甲狀腺超聲篩查無異常，其女兒(3代患者1)為PTC患者且伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其父親已故，生前無甲狀腺相關(guān)疾病病史，其丈夫、兒子及孫子經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查及甲狀腺超聲篩查均正常，女婿未采集血樣送檢。見圖1。

為男性，為女性，、為PTC患者，、為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者，、為已故者，為未采集血樣者，為甲亢患者，為甲減患者，箭頭所指為先證者

1.2 基因檢測(cè)方法

采集PTC患者、多發(fā)性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者和正常親屬的靜脈血各5 mL，分離白細(xì)胞提取DNA樣本，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因，通過Sanger測(cè)序檢測(cè)HABP2基因G534E位點(diǎn)的突變情況。PCR擴(kuò)增的上游引物序列：5′-TGTCTCTGG-TTCACGAGGATG-3′，下游引物序列：5′-TGAGGTCCAGAAGACAGTACC-3′。PCR擴(kuò)增步驟:將DNA樣本初始加熱至95 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用大型染料試劑(應(yīng)用生物系統(tǒng)，加利福尼亞州，美國)和正向引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)(圖2)。采用ABI PRISM 3730自動(dòng)遺傳分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行Sanger測(cè)序。

F1～F8:家系成員,F1、F4和F5是PTC患者，K1:陽性對(duì)照，H2O:陰性對(duì)照

2 結(jié) 果

PTC患者、多發(fā)性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者和患者親屬均未發(fā)現(xiàn)HABP2基因的陽性突變(圖3)。

F1、F2、F5～7:家系成員,F1、F5為PTC患者，K1陽性對(duì)照

3 討 論

現(xiàn)階段甲狀腺癌患者的總體發(fā)病率正在逐年升高[1-2]，F(xiàn)NMTC在甲狀腺癌中總體上雖然占比不高，但其家族遺傳性在所有甲狀腺癌中是最高的[5]，故對(duì)于易感人群的篩查應(yīng)引起足夠重視。FNMTC多為FPTC，這與PTC在甲狀腺癌中占絕大多數(shù)相一致[2-3]。對(duì)于FNMTC的發(fā)病特點(diǎn)及家族性，有研究表明，F(xiàn)NMTC患者的無病生存期明顯短于散發(fā)患者[15]；FNMTC影響患者生存期的特征如下：起病較早，復(fù)發(fā)率更高，與散發(fā)病例相比較生存率更低等[16-17]。來自我國的研究也表明，雙側(cè)病變、多灶性、高中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是FNMTC的臨床特征，且第2代患者的疾病診斷年齡早于第1代[18]。以上結(jié)論均提示，F(xiàn)NMTC相對(duì)于普通的散發(fā)PTC患者可能存在更高的侵襲性，更易導(dǎo)致預(yù)后不良。由于現(xiàn)階段考慮遺傳基因可能是FNMTC患者的主要致病因素，多個(gè)國家學(xué)者擬尋找出不同的基因位點(diǎn)突變以進(jìn)一步闡述該病的發(fā)病機(jī)制，但均未得到廣泛共識(shí)，故該病易感基因尚不明確，仍需多中心研究進(jìn)行證實(shí)[6]。近幾年來發(fā)現(xiàn)了多種不同的可能與該病相關(guān)的基因及其位點(diǎn)突變，如SRGAP1基因(12q14)、TITF-1/NKX2.1基因(14q13)、FOXE1基因(9q22.33)、HABP2基因(10q25.3)突變，同時(shí)還有很多未經(jīng)證實(shí)的基因和位點(diǎn)突變等[19]。最新的研究顯示NOP53可能是FNMTC的候選修飾基因位點(diǎn)[20]，MAPK-ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的通路[21-22]，但仍然需要大量的研究證實(shí)上述結(jié)論。由此可見，及時(shí)對(duì)患者家屬進(jìn)行周期性篩查，可能有助于早期識(shí)別患者，對(duì)于改善患者預(yù)后有極為重要的意義。

近年來相繼有學(xué)者對(duì)HABP2基因G534E位點(diǎn)突變與FNMTC易感相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。GARA等[8]報(bào)道HABP2基因G534E位點(diǎn)突變是FNMTC家系中的致病突變，HABP2可能為腫瘤抑制基因，而G534E位點(diǎn)突變可能導(dǎo)致腫瘤抑制功能喪失。ZHANG等[9]學(xué)者也得出了相似的結(jié)論，并進(jìn)一步證實(shí)了HABP2基因G534E位點(diǎn)突變?cè)贔NMTC的幾個(gè)獨(dú)立的家族中發(fā)生，有14.0%是由HABP2引起，認(rèn)為對(duì)HABP2基因G534E位點(diǎn)的檢測(cè)將可能成為一種有助于識(shí)別高患病風(fēng)險(xiǎn)的FNMTC家系成員的措施。然而，后續(xù)研究則提出了相反的觀點(diǎn)，波蘭、意大利、澳大利亞、西班牙等國家的相關(guān)研究結(jié)果顯示，HABP2基因G534E位點(diǎn)突變并不會(huì)增加這些國家的患者發(fā)生FNMTC的風(fēng)險(xiǎn)，即HABP2基因G534E位點(diǎn)并非FNMTC的致病突變[10-14]。ZHAO等[23]對(duì)中國12個(gè)PTC家系的HABP2 13外顯子及其內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)HABP2突變。同時(shí)對(duì)217例散發(fā)PTC患者的檢測(cè)結(jié)果提示，HABP2基因G534E位點(diǎn)突變可能與中國人群的FPTC發(fā)病無關(guān)。但是他們沒有描述是否這些家系中有包括3個(gè)及以上的直系親屬是患有PTC。如果一個(gè)家族中只有2例PTC，據(jù)估計(jì)，其為散發(fā)PTC的概率為62%～69%，隨著甲狀腺癌發(fā)病率的增高，其概率可能更高[24]。此次在本研究檢測(cè)的4個(gè)家系中，每個(gè)家系一級(jí)親屬中均有2個(gè)及以上確診為PTC的患者，根據(jù)定義，考慮均為FNMTC家系，由于患者均診斷為PTC，可以將其定義為FPTC家系。且PTC患者及其家屬并沒有發(fā)現(xiàn)HABP2基因的陽性突變，提示HABP2基因G534E位點(diǎn)可能不是中國地區(qū)FPTC的易感突變位點(diǎn)。下一步還可以對(duì)患者及家屬的其他基因有無突變情況進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，以獲得更多的數(shù)據(jù)資料，從而驗(yàn)證與FPTC相關(guān)的其他易感基因。

總之，本研究結(jié)果顯示，HABP2基因突變可能不是我國FPTC易感基因，需要進(jìn)一步驗(yàn)證其他基因的突變情況。由于FNMTC的侵襲性較高，為了明確易感基因，可能需要進(jìn)一步尋找FNMTC的其他相關(guān)基因，同時(shí)需要對(duì)多中心大數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析確定，以利于提前篩查、早期診斷，以改善患者預(yù)后。