能一鳴 張崢 李雪 王芳玲 華亞男 侯琳

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山東 青島 266071)

核糖體合成調(diào)節(jié)因子1(RRS1)是一種調(diào)控蛋白，其主要功能是與核糖體產(chǎn)物因子2(RPF2)相互作用，招募核蛋白RPL5、RPL11以及5SrRNA并參與核糖體5SRNP的成熟、60S大亞基的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)[1-3]。編碼RRS1蛋白的基因缺失或突變會引起核糖體組裝異常，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生命活動[4]。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種常用的帕金森病(PD)模型構(gòu)建誘導(dǎo)劑，通過抑制細(xì)胞線粒體活性，促進(jìn)氧化應(yīng)激，引起多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)RRS1的異常表達(dá)與人類腫瘤和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[6-8]，在乳腺癌、胃癌、宮頸癌、肝癌和結(jié)腸癌中，RRS1被認(rèn)為與細(xì)胞的異常增殖相關(guān)，下調(diào)RRS1表達(dá)會引起細(xì)胞增殖抑制和凋亡[9-14]。為了解RRS1與多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同劑量的MPP+處理 SH-SY5Y細(xì)胞，分析細(xì)胞損傷凋亡與RRS1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，再通過慢病毒過表達(dá)RRS1基因，觀察SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)MPP+處理后細(xì)胞凋亡程度的變化，以及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)情況的變化，探討RRS1與MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，胎牛血清、DMEM/HIGH培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MPP+(美國Sigma公司)，胰蛋白酶消化液(0.53 nmol/L)、RIPA蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、CCK-8試劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，JC-1試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，兔抗人RRS1單克隆抗體及Bax、Bcl-2、β-Actin抗體(美國Abcam公司)，兔抗人P53多克隆抗體以及GAPDH抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司)，Anexin V-APC/PI試劑盒(美國Thermo Fi-sher Scientific公司)，慢病毒載體及轉(zhuǎn)染試劑(上海吉?jiǎng)P公司)，qPCR、PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物(北京全式金生物有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細(xì)胞并用胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)以后按照1×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活力 將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化接種于96孔板中，設(shè)置4個(gè)濃度梯度組(每組5個(gè)復(fù)孔，每孔3 000個(gè)細(xì)胞)，細(xì)胞貼壁以后每孔加入含有不同濃度(0、100、200和400 μmol/L)MPP+的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測前1 h每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1 h,以酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.3JC-1法檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化 將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化接種于6孔板中，每孔加入培養(yǎng)基2 mL，在細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度(0、100、200和400 μmol/L)MPP+的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去上清液，每孔加入1 mL培養(yǎng)基和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束以后，吸去上清液，每孔用1×Loading buffer洗滌2次，最后每孔再加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡拍照，線粒體膜電位由細(xì)胞紅綠熒光強(qiáng)度比值表示，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.4Annexin V-APC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化接種于6孔板，待細(xì)胞融合度約70%時(shí)，更換含有0、100、200和400 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，小心收集細(xì)胞，按照Annexin V-APC/PI實(shí)驗(yàn)說明書檢測細(xì)胞凋亡情況。以Annexin V-APC(-)/PI(+)為壞死細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，以Annexin V-APC(+)/PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，以Annexin V-APC(+)/PI(-)為早期凋亡細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，以Annexin V-APC(-)/PI(-)為正常細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞P53、RRS1、Bcl-2以及Bax的表達(dá) 用含有0、100、200和400 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基培養(yǎng)對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗1次；用RIPA裂解法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；加入1/4體積的5×loading buffer后煮沸10 min使蛋白質(zhì)高溫變性；按30 μg總蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)結(jié)束后用含有50 g/L BSA的封閉液室溫封閉2 h；分別加入一抗Anti-RRS1(1∶1 000)、Anti-P53(1∶1 000)、Anti-Bcl-2(1∶1 000)、Anti-Bax(1∶1 000)、Anti-GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，重復(fù)TBST的洗膜步驟；將ECL顯影液滴加至PVDF膜上，避光1 min；放入成像系統(tǒng)顯影拍照并分析條帶灰度值；以GAPDH為內(nèi)參照，將目的蛋白與內(nèi)參照的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算蛋白相對表達(dá)率。

1.2.6慢病毒的構(gòu)建 從NCBI中獲取RRS1基因的CDS全部序列，由上海吉?jiǎng)P公司合成慢病毒，選擇編號為GV365的過表達(dá)質(zhì)粒載體，載體元件為hU6-MCS-3FLAG-CMV-EGFP。為排除載體造成的影響，設(shè)置以亂序?yàn)楹诵男蛄械年幮詫φ眨謩e得到過表達(dá)慢病毒Lv-RRS1和陰性對照慢病毒。

1.2.7慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞 根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染操作手冊設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出Lv-RRS1及其對照的MOI值為30，以含有Lv-RRS1和對照慢病毒的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基分別培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞8 h，棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，更換含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，得到轉(zhuǎn)染后的Lv-RRS1組和對照組兩組細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況，選取80%以上轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8qPCR檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用Trizol法提取總RNA,檢測RNA的濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存；配置qPCR反應(yīng)體系，采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,進(jìn)行40次循環(huán)，采集每一次循環(huán)的熒光信號，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，比較轉(zhuǎn)染組和對照組的相對表達(dá)豐度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。RRS1引物：正義鏈5′-CCCTACCGGACAC-CAGAGTAA-3′，反義鏈5′-CCGAAAAGGGGTTGAAACTTCC-3′；以GADPH為內(nèi)參照，GAPDH的引物序列為：正義鏈5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反義鏈5′-AGGGGCCATCCACAG-TCTTC-3′。

1.2.9Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞RRS1蛋白表達(dá)情況 將轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，分別用PBS洗1次，RIPA蛋白裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，方法同1.2.5。

1.2.10CCK-8檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染的Lv-RRS1組和對照組細(xì)胞消化接種于96孔板，每組細(xì)胞5個(gè)復(fù)孔，每孔約3 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，更換為含有400 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，方法同1.2.2。

1.2.11Annexin V-APC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況 取轉(zhuǎn)染的Lv-RRS1組和對照組細(xì)胞消化接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)更換為含有400 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，小心收集細(xì)胞，方法同1.2.4。

1.2.12Western blot檢測細(xì)胞RRS1、P53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞處理方法同1.2.11，RIPA裂解法提取總蛋白，其余步驟同1.2.5。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果

0、100、200、400 μmol/L MPP+組細(xì)胞增殖活力分別為1.00±0.00、0.89±0.01、0.79±0.02、0.62±0.01，隨MPP+濃度增大細(xì)胞增殖活力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.63，P<0.05)。

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位檢測情況

熒光圖片顯示，隨MPP+濃度增大，紅色熒光強(qiáng)度逐漸減弱，綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，0、100、200、400 μmol/L MPP+組的紅綠熒光強(qiáng)度比值分別為7.46±0.56、4.37±0.42、2.97±0.68和1.97±0.21，隨著MPP+濃度增大，細(xì)胞紅綠熒光強(qiáng)度比值顯著下降(F=69.90，P<0.05)。見圖1。

A、B：0 μmol/L MPP+組，C、D：100 μmol/L MPP+組，E、F：200 μmol/L MPP+組，G、H：400 μmol/L MPP+組。JC-1染色

2.3 MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-APC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測48 h細(xì)胞凋亡情況，0、100、200和400 μmol/L MPP+組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.30±0.57)%、(11.44±1.20)%、(19.70±1.27)%和(35.90±1.71)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=258.49，P<0.01)。見圖2。

A、B、C、D分別為0、100、200、400 μmol/L MPP+組

2.4 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)RRS1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

與0 μmol/L MPP+組比較，200和400 μmol/L MPP+組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)P53蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.47，P<0.05)。與0 μmol/L MPP+組比較，100、200及400 μmol/L MPP+組細(xì)胞RRS1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降(F=28.44、42.43，P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(F=20.78，P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞中P53、Bax、Bcl-2和RRS1蛋白的表達(dá)

2.5 RRS1基因過表達(dá)后細(xì)胞RRS1 mRNA與蛋白的表達(dá)水平

Lv-RRS1組和對照組細(xì)胞RRS1 mRNA的表達(dá)水平分別為2.99±0.17、1.00±0.00，與對照組相比，Lv-RRS1組細(xì)胞RRS1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(t=15.59，P<0.01)。Lv-RRS1組和對照組細(xì)胞RRS1蛋白表達(dá)水平分別為1.81±0.11、1.03±0.13，與對照組相比，Lv-RRS1組細(xì)胞RRS1蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.05，P<0.01)。

2.6 RRS1基因過表達(dá)后細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果

Lv-RRS1組和對照組的細(xì)胞增殖活力分別為0.59±0.01、0.67±0.02，Lv-RRS1組的細(xì)胞活力明顯高于對照組(t=4.76，P<0.01)。

2.7 流式細(xì)胞儀檢測RRS1基因過表達(dá)和敲降后細(xì)胞凋亡情況

Lv-RRS1組和對照組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡比例分別為(29.63±1.68)%、(38.00±1.16)%，Lv-RRS1組的細(xì)胞凋亡比例明顯低于對照組(t=5.80，P<0.01)。

2.8 兩組RRS1及凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

Lv-RRS1組RRS1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(t=12.41、3.14，P<0.01)；P53蛋白和Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(t=5.20、4.77，P<0.05)。見表2。

表2 過表達(dá)RRS1基因后細(xì)胞RRS1、P53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

PD是一種中老年常見的神經(jīng)退行性疾病，由于中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)途徑活性降低，膽堿能神經(jīng)元活性亢進(jìn)，引起患者震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動障礙，臨床常用左旋多巴胺藥物治療或深部腦刺激來改善癥狀[15-16]，尚無方法治愈。核糖體生物生成障礙會引起P53依賴性細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，稱之為“核仁應(yīng)激”[17]。核仁是rDNA轉(zhuǎn)錄和核糖體亞基組裝的場所，當(dāng)核仁處于應(yīng)激時(shí)，核仁結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，一些核蛋白被釋放進(jìn)入核漿，如RPL5、RPL1、RPL23、RPS3以及RPS27a可以與鼠雙微粒體2(MDM2)結(jié)合導(dǎo)致P53的活化和細(xì)胞衰老[18-20],P53可以通過促進(jìn)促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)線粒體通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡；相反，P53基因缺失對PD模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[21]，MDM2-P53通路是PD中的一個(gè)重要的信號途徑[22-23]。

MDM2-P53信號通路一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)有研究表明RRS1蛋白可以在核仁中與核蛋白RPL11結(jié)合，當(dāng)RRS1基因被沉默后，RPL11離開核仁進(jìn)入核漿與E3泛素連接酶MDM2結(jié)合加強(qiáng)，P53蛋白失去抑制被激活[24-25]，引起細(xì)胞的凋亡，提示沉默RRS1可能通過P53信號途徑引起細(xì)胞的凋亡。另外RRS1與亨廷頓病聯(lián)系密切，亨廷頓病是一種顯性遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床發(fā)現(xiàn)HD患者的腦組織RRS1基因的表達(dá)上調(diào)，在HD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)RRS1基因在腦組織中表達(dá)明顯升高，RRS1通過感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，在異黏蛋白的作用下傳遞信號，參與亨廷頓病的發(fā)生以及發(fā)展[8,26]。然而RRS1與其他神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系研究較少，特別是RRS1與PD多巴胺能神經(jīng)元異常凋亡的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究以MPP+作為構(gòu)建PD細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑，使用不同濃度的MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，用CCK-8、JC-1和流式細(xì)胞術(shù)方法分析細(xì)胞增殖和凋亡情況，結(jié)果顯示在0～400 μmol/L濃度區(qū)間的MPP+可以導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的明顯降低，處理48 h后細(xì)胞增殖活力下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡率升高。Western blot檢測MPP+處理細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和RRS1的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著MPP+濃度增加，細(xì)胞P53、Bax表達(dá)升高，RRS1、Bcl-1表達(dá)降低，表明RRS1在MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中表達(dá)降低。為進(jìn)一步驗(yàn)證RRS1與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，通過慢病毒載體過表達(dá)RRS1基因的方式上調(diào)細(xì)胞中RRS1的蛋白表達(dá)量，再用400 μmol/L MPP+處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞48 h構(gòu)建PD細(xì)胞模型，并對細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行再次檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，上調(diào)RRS1表達(dá)后SH-SY5Y細(xì)胞增殖活力升高，且細(xì)胞凋亡減少，表明RRS1參與并影響了細(xì)胞的凋亡過程。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對補(bǔ)償RRS1表達(dá)后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax和Bcl-1的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，上調(diào)RRS1表達(dá)后，促凋亡蛋白P53和Bax表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高，與對照組產(chǎn)生了截然相反的結(jié)果，提示RRS1可能是通過P53以及Bax/Bcl-2信號途徑參與MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程。本研究為RRS1在PD細(xì)胞模型的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，然而RRS1在PD模型細(xì)胞凋亡過程是否存在其他調(diào)控機(jī)制尚不清楚，其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的具體作用還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的過程中，RRS1蛋白表達(dá)下降，RRS1可能通過影響凋亡相關(guān)因子P53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)參與MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。初步顯示了RRS1在PD細(xì)胞模型中的作用及意義。