劉夢馨 楊茜 張京，3 王建勛

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科； 3 青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)

動脈粥樣硬化是最常見和最具危害性的疾病之一，嚴(yán)重影響人們的生命安全和生活質(zhì)量[1-2]。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要誘因。因此，針對調(diào)控VSMC凋亡的研究對預(yù)防和治療動脈粥樣硬化具有重要的醫(yī)學(xué)意義。ARC是一種內(nèi)源性的凋亡抑制蛋白，在終末分化細(xì)胞如心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞中高表達(dá)[3-5]。ARC可以抑制多種細(xì)胞死亡途徑，包括由外源性(死亡受體)和內(nèi)源性(線粒體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng))凋亡途徑引發(fā)的細(xì)胞死亡，以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的不依賴于caspase的細(xì)胞死亡[6-7]。近年來有關(guān)ARC的研究主要在心肌細(xì)胞中進(jìn)行，有研究發(fā)現(xiàn)ARC通過抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8]。心肌細(xì)胞中ARC表達(dá)下調(diào)與心肌梗死、心肌肥大等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，ARC不僅能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[11]，而且還可以抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞程序性壞死。也有研究顯示，ARC在腫瘤細(xì)胞、組織中高表達(dá)[12-13]。以上證據(jù)表明ARC可能參與調(diào)控了心肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞的凋亡。值得關(guān)注的是，最近有研究表明，經(jīng)無血清培養(yǎng)(SD)后肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)中ARC的表達(dá)上調(diào)，并且ARC還可抑制SD誘導(dǎo)的PASMC的凋亡[14]。在慢性缺氧條件下，ARC敲除后PASMC的凋亡增加，這表明ARC在調(diào)控PASMC凋亡的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[15]。然而ARC能否在人主動脈VSMC(HA-VSMC)中表達(dá)，是否參與調(diào)控HA-VSMC的凋亡尚不清楚，本研究旨在進(jìn)一步探討ARC對HA-VSMC凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

HA-VSMC、大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)、人胚胎腎細(xì)胞293(HEK293)、人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)為本實(shí)驗(yàn)室所有，在液氮中凍存；ARC抗體購自美國CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2、HA-VSMC、HAEC以及HEK293接種在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)到對數(shù)生長期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2腺病毒的擴(kuò)增和感染 ARC和β-gal過表達(dá)腺病毒為本實(shí)驗(yàn)室所存[16]。將HEK293細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，加入腺病毒進(jìn)行感染。3 d后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)空洞，收集細(xì)胞，于-80 ℃反復(fù)凍融3次后，以12 000 r/min離心5 min，收集上清液中更多的腺病毒，于-80 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細(xì)胞ARC的相對表達(dá)水平 在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)H9c2(A組)、HA-VSMC(B組)、HAEC(C組)、HEK293(D組)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%及以上時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后置于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol RNAiso(日本Takara公司生產(chǎn))提取細(xì)胞總RNA，然后使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，最后采用Takara熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。

在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)HA-VSMC，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，采用100 μmol/L的H2O2時(shí)間梯度處理HA-VSMC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、H2O2+3 h組h(B組)、H2O2+6 h組(C組)、H2O2+12 h組(D組)。加入1 mL Trizol RNAiso試劑提取總RNA，再采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用Takara熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測細(xì)胞ARC的表達(dá)。

ARC引物：正向5′-GACCGCAGCTATGACC-CTC-3′，反向5′-CTCCGGTTCAGCCTCTTTAGA-3′。GAPDH引物：正向5′-TGTGTCCGTCGTGG-ATCTGA-3′，反向5′-CCTGCTTCACCACCTTC-TTGA-3′。

1.2.4Western blot方法檢測細(xì)胞中ARC的相對表達(dá)量 在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)HA-VSMC，實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、β-gal組(B組)、Ad-ARC組(C組)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，加入腺病毒感染細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞提取總蛋白，注意全程在冰上進(jìn)行避免蛋白降解。然后按照比例加入4×上樣緩沖液，渦旋混勻后，使用金屬浴于98 ℃加熱10 min。在SDS-PAGE凝膠中上樣30 μg蛋白溶液，80 V電壓下壓線，待樣品壓平以后，電壓改為120 V恒壓1.5 h。后用體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入ARC一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后用ECL蛋白質(zhì)印跡底物檢測條帶，并在蛋白凝膠成像系統(tǒng)上曝光。

1.2.5caspase3/7活性實(shí)驗(yàn)檢測ARC對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 在96孔板中常規(guī)培養(yǎng)HA-VSMC，實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、H2O2(B組)、H2O2+β-gal(C組)、H2O2+Ad-ARC(D組)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約70%時(shí)，加入腺病毒感染細(xì)胞24 h，再加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次；加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中；后根據(jù)caspase 3/7活性測定試劑盒(meilunbio，中國大連)說明書操作，最后使用酶標(biāo)儀檢測405 nm波長下的吸光度值。

1.2.6錐蟲藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)檢測ARC對于H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 在6孔板中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)HA-VSMC，實(shí)驗(yàn)分為對照組(A組)、H2O2(B組)、H2O2+β-gal(C組)、H2O2+Ad-ARC(D組)。當(dāng)細(xì)胞密度約70%時(shí)，加入腺病毒感染細(xì)胞24 h，再加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次；加入2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中；取10 μL細(xì)胞懸液與10 μL錐蟲藍(lán)工作液混勻，室溫靜置3 min；然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 ARC在不同細(xì)胞系中的相對表達(dá)量

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D組細(xì)胞ARC相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.70±0.02、0.30±0.01、0.05±0.00，B組和C組細(xì)胞ARC的表達(dá)量比較差異具有顯著性(F=84.50，t=8.67，P<0.05)。因此，本研究將HA-VSMC作為主要研究對象。

2.2 H2O2處理后各組細(xì)胞ARC相對表達(dá)量比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D組中ARC相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.80±0.02、0.60±0.05、0.40±0.01，與A組相比，隨著H2O2處理時(shí)間的延長，細(xì)胞中ARC相對表達(dá)量逐漸降低，差異有顯著性(F=8.83，P<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染Ad-ARC和β-gal對HA-VSMC ARC表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，A、B、C組HA-VSMC ARC相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、1.01±0.02、5.20±0.20，與A、B組相比，C組中ARC相對表達(dá)量顯著上調(diào)，差異具有顯著性(F=296.00，P<0.01)，即成功在HA-VSMC中構(gòu)建ARC的過表達(dá)腺病毒。見圖1。

圖1 Ad-ARC在HA-VSMC中過表達(dá)

2.4 過表達(dá)ARC對HA-VSMC凋亡的影響

2.4.1過表達(dá)ARC對HA-VSMC caspase3/7活性的影響 酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D組HA-VSMC的吸光值分別為0.99±0.05、3.92±0.20、3.89±0.50、2.18±0.01，C組和D組間比較差異具有顯著性(F=55.46，t=6.96，P<0.05)。

2.4.2ARC對細(xì)胞凋亡的抑制作用 錐蟲藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B、C、D組細(xì)胞錐蟲藍(lán)陽性細(xì)胞數(shù)分別為4±2、28±4、29±5、15±2，C組和D組間比較差異有顯著性(F=190.10，t=12.40，P<0.05)。

3 討 論

細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化斑塊形成及再狹窄的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在動脈粥樣硬化的斑塊中有多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，如VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[17]。針對細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化中相關(guān)分子機(jī)制的深入研究，可以幫助尋找新的治療靶點(diǎn)。VSMC的凋亡是多種血管疾病，如動脈粥樣硬化和肺動脈高壓等中最常見的病理過程[18-19]。因此，針對調(diào)控VSMC凋亡的研究，對尋找血管疾病新的治療方法具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，ARC在HA-VSMC中表達(dá)且表達(dá)量高于在HAEC中，推測ARC可能在HA-VSMC中發(fā)揮作用。近年來有關(guān)ARC的研究主要在心肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行，研究顯示ARC通過抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，ARC在腫瘤細(xì)胞和組織中高表達(dá),從而發(fā)揮其抗凋亡的功能。但是ARC是否參與調(diào)控HA-VSMC的凋亡尚不清楚。

在動脈粥樣硬化發(fā)展中的不同時(shí)期，VSMC的凋亡程度也不同，在斑塊期VSMC的凋亡明顯增加，VSMC的凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)展過程的的重要因素[20]。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，在H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的條件下，ARC的表達(dá)量明顯下調(diào)，我們推測ARC可能參與H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在本研究中,使用腺病毒Ad-ARC在HA-VSMC中過表達(dá)ARC，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示C組中ARC的蛋白表達(dá)水平較A組和B組明顯增高，這表明在轉(zhuǎn)染Ad-ARC后HA-VSMC中的ARC被顯著過表達(dá)。進(jìn)一步通過caspase3/7活性實(shí)驗(yàn)和錐蟲藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)證明，在H2O2處理HA-VSMC的同時(shí)過表達(dá)ARC，過表達(dá)的ARC可以明顯地抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均證明了ARC在抑制HA-VSMC凋亡中的關(guān)鍵作用，因此我們推測ARC有可能為治療動脈粥樣硬化和其他血管疾病提供新的靶點(diǎn)。

在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，VSMC的增殖也伴隨始終。有研究顯示，在慢性缺氧的條件下，ARC敲除小鼠對肺動脈高壓有明顯的抗性，并且敲除ARC后PASMC的增殖減少，細(xì)胞凋亡增加[15]。ARC可拮抗唑來磷酸對成骨細(xì)胞產(chǎn)生的不利影響，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和分化，并且降低細(xì)胞凋亡[21]。ARC的過表達(dá)通過與caspase作用而抑制肌原細(xì)胞分化[22]。以上證據(jù)表明ARC還可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。但ARC能否在VSMC的增殖中發(fā)揮作用還缺乏更深入的研究，有關(guān)ARC與VSMC增殖關(guān)系的研究我們正在開展。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，抗凋亡蛋白ARC在HA-VSMC當(dāng)中高表達(dá)，過表達(dá)ARC可以抑制H2O2誘導(dǎo)的HA-VSMC的凋亡，其發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。