王芳玲 王軍 李雪 華亞男 侯琳

(青島大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，山東 青島 266071)

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界癌癥發(fā)病率中排第2位，是女性死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌的早期診斷和標準化治療大大提高了患者的生存率和預后，早期乳腺癌患者總體5年生存率達到90%，但是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者總體生存率僅為26%[2-3]。轉(zhuǎn)移性乳腺癌也被稱為晚期乳腺癌，是致命的乳腺癌[4-6]。尋找與乳腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關的功能基因，是對該疾病實現(xiàn)精準治療及預警的重要基礎。核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)參與Pre-rRNA的加工及核糖體生物合成。研究顯示，RRS1基因在許多人類腫瘤中過表達，如宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等[7-11]。RRS1還可通過RPL11/MDM2介導p53激活來促進乳腺癌的增殖[12]。然而，RRS1是否在乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用仍然未知。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個重要方面[13]。上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)是典型的上皮間質(zhì)細胞標志物，磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)、糖原合成激酶3(GSK3β)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)蛋白是調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化重要的相關蛋白。本研究通過將RRS1基因過表達和RRS1基因敲降的方法進行細胞侵襲轉(zhuǎn)移功能分析，通過檢測MDA-MB-231細胞中E-cadherin、Vimentin、P-AKT、GSK3β和Snail蛋白的相對表達情況，探討RRS1基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞的襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT549及正常乳腺上皮細胞HMEC(中國科學院昆明細胞庫)。DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液(美國HyClone公司)，BI胎牛血清(中國山東博康公司)，青鏈霉素混合液(中國北京索萊寶公司)，RRS1過表達質(zhì)粒、對照質(zhì)粒(中國上海漢恒科技有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑lipo2000、Trizol Reagent(美國Invitrogen公司)，RRS1干擾慢病毒(中國上海吉凱公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)，Transwell小室(美國Millipore公司)，RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)，鼠抗人RRS1、GAPDH單克隆抗體以及兔抗人Snail、E-cadherine、Vimentin、AKT、GSK3β多克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

使用含有體積分數(shù)0.10胎牛血清和0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BT549、MDA-MB-231、HMEC細胞，置于37℃、含有體積分數(shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待細胞融合達80%～90%時進行傳代。在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)MDA-MB-231細胞，當匯合率到70%左右時，細胞分別轉(zhuǎn)染慢病毒shRNA-Ctrl、shRNA-RRS1、空載質(zhì)粒以及RRS1過表達質(zhì)粒，細胞分為空白處理組(A組)、轉(zhuǎn)染shRNA-Ctrl組(B組)、轉(zhuǎn)染shRNA-RRS1組(C組)、轉(zhuǎn)染Vector組(D組)及轉(zhuǎn)染Vector-RRS1組(E組)。

1.3 Western blot實驗檢測HMEC、BT549、MDA-MB-231細胞中RRS1蛋白的相對表達量

收集細胞，分別提取HMEC、BT549、MDA-MB-231細胞總蛋白，蛋白抽提方法按試劑盒提供的流程，BCA法測蛋白濃度。進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加GAPDH一抗以及RRS1蛋白一抗(1∶1 000)，常溫孵育2 h，用1×TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗溶液，室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜3次，每次10 min；最后將ECL發(fā)光液按說明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH條帶結(jié)果為內(nèi)參照，將各樣品RRS1蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中RRS1蛋白相對含量。

1.4 Transwell實驗、劃痕實驗分析RRS1基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞侵襲、遷移能力的影響

1.4.1劃痕實驗 用Marker筆在6孔板背后均勻畫橫線，橫線間隔0.5～1.0 cm，橫穿過孔。乳腺癌MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染慢病毒或質(zhì)粒48 h后，待5組細胞生長至鋪滿6孔板時，用200 μL槍頭垂直于6孔板背后橫線在培養(yǎng)皿的整個直徑上刮擦細胞以產(chǎn)生劃痕區(qū)域，并用無血清培養(yǎng)基徹底沖洗以除去所有細胞碎片。然后在6孔板中加入無血清培養(yǎng)基，并在12、24、48 h使用顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合情況，實驗重復3次。

1.4.2Transwell實驗 轉(zhuǎn)染慢病毒或質(zhì)粒48 h后，5組細胞在6孔板中匯合至約80%時，每組將105個MDA-MB-231細胞種于24孔板并且置于Transwell小室中，上室加入100 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL含體積分數(shù)為0.30胎牛血清的高糖培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～24 h，每隔1 h觀察細胞遷移情況。直至觀察到下室有細胞出現(xiàn)時終止培養(yǎng)，取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，用吸水紙吸去上室培養(yǎng)基，滴2～3滴結(jié)晶紫在小室下表面進行染色，5 min后，沖洗結(jié)晶紫，空氣晾干后顯微鏡下進行拍照，實驗重復3次。

1.5 Western blot實驗檢測細胞中E-cadherin、Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量

轉(zhuǎn)染慢病毒或質(zhì)粒48 h后，將5組細胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解，BCA法測蛋白濃度。蛋白在SDS-PAGE上電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h后，加內(nèi)參一抗和目標蛋白一抗(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜，然后用1×TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗溶液孵育1 h，再用1×TBST洗膜3次，每次10 min。最后將ECL發(fā)光液按說明書加到PVDF膜上，室溫放置1 min，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH的條帶結(jié)果為內(nèi)參照，將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量。

2 結(jié) 果

2.1 HMEC、MDA-MB-231及BT549細胞中RRS1蛋白相對表達量比較

Western blot檢測結(jié)果顯示,HMEC、MDA-MB-231、BT549細胞中RRS1蛋白相對表達量分別為1.03±0.03、3.42±0.04、3.19±0.10，乳腺癌MDA-MB-231以及BT549細胞中的RRS1蛋白相對表達量明顯高于正常乳腺上皮HMEC細胞(F=74.71，P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot實驗檢測3種細胞中RRS1蛋白的表達水平

2.2 各組細胞中轉(zhuǎn)染效率比較

乳腺癌MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染慢病毒或質(zhì)粒48 h后，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率達到70%以上。Western blot檢測結(jié)果顯示,A、B、C、D、E組細胞中RRS1蛋白相對表達量分別為0.97±0.01、1.01±0.01、0.43±0.00、0.93±0.06、1.42±0.01，與A、B組比較，C組細胞中RRS1蛋白相對表達量明顯降低，與A、B、C、D組相比較，E組細胞中RRS1蛋白的相對表達量明顯增高(F=33.26，P<0.01)。見圖2。

A、C、B、D、E分別為A、C、B、D、E組

2.3 RRS1對MDA-MB-231細胞遷移侵襲的影響

劃痕實驗結(jié)果表明，A～E組細胞遷移率分別為0.61±0.01、0.62±0.01、0.07±0.00、0.71±0.01、0.85±0.00。與A、B組相比，C組細胞的遷移能力明顯降低,與A、D組相比，E組細胞遷移能力明顯升高(F=187.70，P<0.01)。Transwell實驗結(jié)果表明，A～E組細胞的侵襲率分別為66.00±1.15、66.67±1.09、20.10±1.13、67.83±1.15、83±1.33，與A、B組相比，C組細胞的侵襲能力明顯降低，與A、D組相比較，E組細胞的侵襲能力明顯升高(F=208.30，P<0.01)。

2.4 各組細胞中E-cadherin、Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，與A、B組相比，C組細胞中Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量明顯降低，與A、D組相比，E組細胞中以上蛋白相對表達量明顯升高(F=34.29～69.03，P<0.01)；與A、B組相比，C組細胞中E-cadherin蛋白相對表達量明顯升高，與A、D組相比，E組細胞中E-cadherin蛋白的相對表達量明顯降低(F=36.00，P<0.01)。見表1。

表1 各組細胞當中E-cadherin、Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量比較

3 討 論

乳腺癌的治療以手術(shù)為主要手段，根據(jù)患者的具體情況再輔以化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等，但術(shù)后復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍較高[14]。腫瘤轉(zhuǎn)移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因。有25%～50%的乳腺癌患者最終會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[15-17]。因此，需要了解乳腺癌癌變的根本原因，并確定更多的生物分子用于早期診斷和治療干預。有研究通過對乳腺癌成對樣本進行高通量差異表達基因篩選，新發(fā)現(xiàn)了一個與乳腺癌發(fā)生有關的基因——核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)。RRS1基因參與核糖體5SRNP的裝配、60S大亞基的成熟以及細胞內(nèi)的運輸過程[18-20]。核糖體的合成是核仁的最重要功能，它調(diào)節(jié)細胞生長和細胞分裂[21-22]。核糖體生物合成中的錯誤會導致蛋白質(zhì)合成中的定量或定性缺陷，并因此導致遺傳程序執(zhí)行不當和特定疾病的發(fā)生。本研究旨在探討RRS1基因?qū)θ橄侔┘毎鸐DA-MB-231侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制，以尋找與乳腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關的功能基因，是對乳腺癌疾病實現(xiàn)精準治療及預警的重要基礎。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌MDA-MB-231以及BT549細胞中RRS1蛋白相對表達量明顯高于正常乳腺上皮HMEC細胞，由于MDA-MB-231遷移侵襲能力高于BT549，所以選擇MDA-MB-231細胞進行后續(xù)實驗。隨后，本研究采用含有RRS1基因干擾序列的慢病毒及含有RRS1基因序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞，實現(xiàn)RRS1基因敲降或過表達。Transwell和劃痕實驗表明，RRS1基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞有明顯的促進侵襲以及遷移的作用。Western blot實驗檢測了慢病毒以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞48 h后E-cadherin、Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白的相對表達情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降RRS1基因表達后，間質(zhì)細胞標志物Vimentin蛋白相對表達量下降，上皮細胞的標志物E-cadherin蛋白相對表達量升高，且P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量也下降。過表達RRS1基因后，間質(zhì)細胞標志物Vimentin蛋白相對表達量升高，上皮細胞標志物E-cadherin蛋白相對表達量下降，且P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相對表達量也升高。證明RRS1基因很可能通過激活EMT相關信號通路促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此研究只是在細胞水平上驗證了RRS1基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細胞的作用，后續(xù)的體內(nèi)實驗及具體分子機制還需要進一步的研究。

綜上所述，RRS1可能在乳腺癌中起到原癌基因的作用，促進乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲，且可能是通過激活EMT相關信號來發(fā)揮作用，可能成為乳腺癌治療研究中新的分子靶點基因。