周麗萍，毛曉春，李 琴

(襄陽(yáng)市中心醫(yī)院 眼科， 湖北 襄陽(yáng) 441000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致失明，極大地影響患者身心健康[1]。目前，DR的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，并且無(wú)確切有效的治療方法，探討DR的發(fā)病機(jī)制并尋找安全有效的治療方法具有重要意義。高血糖能夠加速細(xì)胞凋亡引起視網(wǎng)膜缺血、壞死，新生血管釋放產(chǎn)生新生血管[2]。DR與高血糖引起的生理、生化改變?cè)斐傻拿?xì)血管損傷有關(guān)[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22～25個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA，其與血管性疾病、新生血管的形成等關(guān)系密切[4-6]。微小RNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinalendothelial cells，HRECs)中miR-1908表達(dá)下調(diào)[7]，但miR-1908對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制還不清楚。本研究主要探討了miR-1908對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，以期為闡明DR發(fā)病機(jī)制及分子治療靶點(diǎn)的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑

人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系(human retinalendothelial cells，HRECs)(ATCC細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)基( Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)；miR-1908模擬物(mimics)及模擬陰性對(duì)照物、整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的小干擾RNA(基爾頓生物科技上海有限公司)；Trizol試劑(Tiangen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；PAGE膜(Bio-RAD公司)；ILK抗體(Santa Cruz公司)；B淋巴細(xì)胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase，GAPDH)抗體(CST公司)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG(北京中山生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：復(fù)蘇HRECs細(xì)胞，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖)，置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞增殖狀況，每2～3 d換液1次。待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖期的5～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說(shuō)明，分別將miR-1908 mimics(miR-1908組)、模擬陰性對(duì)照物(miR-NC組)、miR-1908 抑制劑(anti-miR-1908組)、抑制劑陰性對(duì)照(anti-NC組)、ILK的小干擾RNA(si-ILK組)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC組)、miR-1908 mimics與ILK過(guò)表達(dá)載體(miR-1908 +pcDNA3.1-ILK)、miR-1908 mimics與空載體(miR-1908 +pcDNA3.1組)轉(zhuǎn)染至HRECs細(xì)胞。將HRECs細(xì)胞分為8組：1)對(duì)照組：正常培養(yǎng)(5.5 mmol/L葡萄糖)；2)高糖組：25 mmol/L[8]葡萄糖干預(yù)HRECs細(xì)胞；3)高糖+ miR-NC組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù)miR-NC組細(xì)胞24 h；4)高糖+ miR-1908組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù)轉(zhuǎn)染miR-1908組細(xì)胞24 h；5)高糖+ si-NC組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù) si-NC組24 h；6)高糖+ si-ILK組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù)si-ILK組細(xì)胞24 h；7)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù)miR-1908+pcDNA3.1組細(xì)胞24 h；8)高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK組：25 mmol/L葡萄糖干預(yù)miR-1908+pcDNA3.1-ILK組細(xì)胞24 h。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-1908表達(dá)水平：使用Trizol試劑提取HRECs細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-1908的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：各組HRECs細(xì)胞培養(yǎng)后用胰蛋白酶消化，PBS溶液清洗后，加入100 μL緩沖液，輕輕吹打重懸細(xì)胞。然后加入10 μL的Annexin-V-FITC，室溫避光孵育20 min。再加入5 μL的PI，混合均勻，室溫避光孵育15 min。最后加入500 μL緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，置于冰上充分裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，分離后轉(zhuǎn)移至PAGE膜，使用5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入ILK(稀釋度1∶150)、Bcl-2(稀釋度1∶500)、Bax(稀釋度1∶500)和GAPDH(稀釋度1∶500)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG，室溫孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ILK的3′UTR含有miR-1908的互補(bǔ)序列。用PCR擴(kuò)增兩者結(jié)合位點(diǎn)的片段，將該片段插入pMIR-REPORT熒光素酶載體中，構(gòu)建ILK野生型質(zhì)粒(WT-ILK)，并使用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建 ILK突變型質(zhì)粒(MUT-ILK)。將miR-NC與WT-ILK(miR-NC+WT-ILK組)、miR-1908與WT-ILK(miR-1908+WT-ILK組)、miR-NC與MUT-ILK(miR-NC+MUT-ILK組)、miR-1908與MUT-ILK(miR-1908+MUT-ILK組)共轉(zhuǎn)染至HRECs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，參照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-1908在高糖作用的HRECs細(xì)胞中的表達(dá)水平

與低糖組比，高糖組HRECs細(xì)胞中miR-1908的表達(dá)水平顯著降低(圖1)(P<0.05)。

*P<0.05 compared with LG group圖1 高糖對(duì)HRECs細(xì)胞中 miR-1908表達(dá)的影響Fig 1 Effect of high glucose on the expression ofmiR-1908 in HRECs cells

2.2 過(guò)表達(dá)miR-1908對(duì)高糖作用的HRECs細(xì)胞凋亡的影響

與高糖+ miR-NC組比，高糖+ miR-1908組HRECs細(xì)胞中miR-1908表達(dá)水平和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，HRECs細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖2，表1)(P<0.05)。

表1 過(guò)表達(dá)miR-1908對(duì)高糖作用的HRECs細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 miR-1908靶向調(diào)控ILK表達(dá)

ILK的3′UTR含有miR-1908的互補(bǔ)序列(圖3A)。miR-1908可降低ILK野生型3′UTR的熒光素酶活性(表2)(P<0.05)。與miR-NC組比，miR-1908組HRECs細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比，anti-miR-1908組HRECs細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3B，表3)(P<0.05)。

A.flow cytometry; B,C.effect of over-expression of microRNA-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG and miR-NC group

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

A.ILK’s 3′UTR contained complementary sequences of miR-1908; B.miR-1908 regulated the expression of ILK圖3 miR-1908靶向、調(diào)控ILKFig 3 miR-1908 targeted and regulated ILK

表3 miR-1908調(diào)控ILK的表達(dá)

2.4 抑制ILK表達(dá)對(duì)高糖作用的HRECs細(xì)胞凋亡的影響

與高糖+ si-NC組比，高糖+ si-ILK組HRECs細(xì)胞中ILK和Bax蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖4)(P<0.05)。

2.5 過(guò)表達(dá)ILK能逆轉(zhuǎn)miR-1908對(duì)高糖作用的HRECs細(xì)胞凋亡的影響

與高糖+miR-1908+pcDNA3.1組比，高糖+ miR-1908+pcDNA3.1-ILK組HRECs細(xì)胞中ILK和Bax蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖5)(P<0.05)。

3 討論

DR是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，高血糖是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一[9]。高血糖環(huán)境可引起細(xì)胞代謝發(fā)生變化，異常凋亡引起器官功能紊亂。目前，DR發(fā)生和發(fā)展的病理機(jī)制尚未十分清楚。探討影響高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，有助于闡明該疾病的發(fā)病機(jī)制，并尋找有效的治療靶點(diǎn)。

miRNA參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等各種生物學(xué)行為，在疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。miR-1908在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-1908可抑制其增殖，是非小細(xì)胞肺癌的治療靶點(diǎn)[11]。miR-1908在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)， 上調(diào)miR-1908表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力[12]，說(shuō)明miR-1908在不同疾病中發(fā)揮的作用不同。目前，miR-1908對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)可促進(jìn)HRECs細(xì)胞miR-1908的表達(dá)，提示miR-1908可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1908能夠降低高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡率，并上調(diào)HRECs細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，提示miR-1908可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡，更詳盡的調(diào)控機(jī)制有待深入探討。

A,B.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic protein expression of hrecs induced by high glucose; C.effect of inhibiting ilk expression on apoptotic rate of hrecs induced by high glucose; *P<0.05 compared with HG+si-NC group

A,B.over-expression of ILK can reverse miR-1908 on apoptotic protein expression of HRECs induced by high glucose; C.overe-xpression of ILK can reverse the apoptosis rate of HRECs induced by miR-1908; *P<0.05 compared with HG+miR-NC group; #P<0.05 compared with HG +miR-1908+pcDNA3.1 group

miRNA通過(guò)與靶mRNA互不配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。為了進(jìn)一步探討miR-1908影響高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究首先利用TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，整合素連接激酶(ILK)的3′UTR含有miR-1908的互補(bǔ)序列，提示miR-1908可能調(diào)控ILK表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)了miR-1908可與ILK的3′UTR靶向結(jié)合。同時(shí)上調(diào)miR-1908表達(dá)HRECs細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)降低，而下調(diào)miR-1908表達(dá)HRECs細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步說(shuō)明miR-1908靶向負(fù)調(diào)控ILK表達(dá)。

ILK是一種高度保守的蛋白，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化等生物學(xué)行為。作為一種多功能調(diào)節(jié)因子，ILK參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展[15]。本研究結(jié)果顯示，抑制ILK可能通過(guò)上調(diào)HRECs細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)并下調(diào)Bax表達(dá)，抑制了高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡。此外，過(guò)表達(dá)ILK部分逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-1908對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡及對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，提示miR-1908可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控ILK表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)并下調(diào)Bax表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs細(xì)胞凋亡，是DR疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-1908參與調(diào)控HRECs細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與負(fù)調(diào)控ILK影響B(tài)cl-2和Bax蛋白表達(dá)有關(guān)，是糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的潛在分子靶點(diǎn)。