田小星，秦溧嬪，李 茜

(重慶市第五人民醫(yī)院 感染性疾病科, 重慶 400062)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)的侵襲和遷移與細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的基因調(diào)控有關(guān)，這些基因通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響肝癌細(xì)胞向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”，人們認(rèn)為其在生命進(jìn)程中沒有調(diào)控功能，隨著研究不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNA不僅參與正常生理過程，還與疾病的發(fā)生有關(guān)[2]。在心血管系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤等常見疾病中均發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達(dá)，lncRNA也逐漸成為靶向治療疾病的潛在靶點(diǎn)[3]。lncRNA 組織分化誘導(dǎo)非蛋白編碼RNA(tissue differentiation inducing non-protein coding RNA,TINCR)參與腫瘤進(jìn)展，在不同的腫瘤組織中的作用不同，TINCR在前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑制作用，而在非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)作用[4-5]。研究報(bào)道顯示，TINCR在肝癌組織中的表達(dá)水平高于正常癌旁組織，并且TINCR高表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)[6]。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TINCR與miR-7有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miR-7是一個(gè)在肝癌中表達(dá)下調(diào)的腫瘤抑制因子，可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移[7]。本次實(shí)驗(yàn)探討TINCR對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響和靶向調(diào)控機(jī)制，為靶向基因治療肝癌提供資料，為研究肝癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細(xì)胞L-02和肝癌細(xì)胞系HCC9204、Huh7、SNU449(ATCC公司)；引物(金斯瑞生物科技股份有限公司)；PrimeScript RT Master Mix試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；shRNA control、TINCR shRNA(湖南豐暉生物科技有限公司)；MMP-9抗體(Affinity Biosciences公司)；miR-7 mimics、mimics control、inhibitor control、miR-7 inhibitor(上海正茂生物科技有限公司)；MMP-2抗體(北京義翹神州科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR測(cè)定肝癌細(xì)胞中TINCR表達(dá)變化:收集對(duì)數(shù)期的正常肝細(xì)胞L-02和肝癌細(xì)胞HCC9204、Huh7、SNU449，在細(xì)胞中添加Trizol裂解試劑，提取細(xì)胞總RNA，RNA溶解在DEPC水中，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280。cDNA合成用PrimeScript RT Master Mix試劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μL的RT Enzyme Mix Ⅰ、4 μL的5×PrimeCSript RT、1 μL的Oligo dT Primer、1 μL的Random 6 mers、2 μL的RNA，添加RNase Free-H2O補(bǔ)足20 μL；反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行real-time PCR，PCR體系為：0.8 μL的forward和reverse primer、2 μL的cDNA、10 μL的Premix Ex Taq Ⅱ、0.4 μL的ROX Reference DyeII，添加RNase free-H2O補(bǔ)足20 μL；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。按照2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。引物：TINCR 上游引物： 5′-GCTGAGGTGACGGTCTCAAA-3′，下游引物：5′-GCCTCCCAGTTTCATGGACA-3′。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和下調(diào)效果測(cè)定:將肝癌Huh7細(xì)胞分成對(duì)照、sh-NC、sh-TINCR組，sh-NC、sh-TINCR組細(xì)胞分別為用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染shRNA control、TINCR shRNA的Huh7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染具體步驟按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。取培養(yǎng)24 h以后的對(duì)照、sh-NC、sh-TINCR組細(xì)胞，用real-time PCR方法測(cè)定TINCR表達(dá)變化，步驟同1.2.1。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定肝癌細(xì)胞增殖:將3組細(xì)胞接種到96孔板中，每個(gè)孔中添加4 000個(gè)細(xì)胞、100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞板放在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將上清吸棄。然后在細(xì)胞中添加CCK-8工作液10 μL和100 μL的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。避光反應(yīng)2 h以后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的A值，檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)整為450 nm。

1.2.4 Transwell小室測(cè)定肝癌細(xì)胞遷移和侵襲:取出在-20 ℃保存的Matrigel，吸取600 μL的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液添加到100 μL的Matrigel中。在放入24孔板中的Transwell小室中添加40 μL的Matrigel稀釋液，放在37 ℃孵育30 min將小室濕化。Control、sh-NC、sh-TINCR組共3組細(xì)胞用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，吸取100 μL添加到小室的上室中，然后在下室中添加500 μL的含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以冰預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液固定30 min，然后用0.1%的結(jié)晶紫染色10 min。在400×顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)目，結(jié)果取均值。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前不用Matrigel濕化小室，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.5 Western blot測(cè)定肝癌細(xì)胞中MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá):收集對(duì)數(shù)期的對(duì)照、sh-NC、sh-TINCR組共3組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。在細(xì)胞蛋白中加入1/2體積的上樣緩沖液充分混合煮沸5 min。SDS-PAGE凝膠電泳蛋白上樣量為30 μg，在濃縮膠中使用80V電壓電泳至溴酚藍(lán)染料進(jìn)入分離膠，然后調(diào)整到100 V電壓電泳至溴酚藍(lán)染料進(jìn)入凝膠底部邊緣1 cm處。取出凝膠，在4 ℃環(huán)境下把蛋白電轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜電流設(shè)置為200 mA恒流。取出NC膜，放在封閉液(含有5%脫脂奶粉的TBST)中，于室溫環(huán)境下結(jié)合1.5 h；然后放在一抗稀釋液(用封閉液按照1∶1 000稀釋)中，于4 ℃條件下孵育過夜；最后將NC膜放在二抗稀釋液(用封閉液按照1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗)中，在室溫環(huán)境中孵育1.5 h。按照ECL顯色試劑盒顯色。Image J軟件分析條帶的灰度值，GAPDH作為內(nèi)參，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量變化。

1.2.6 TINCR靶向關(guān)系預(yù)測(cè)以及鑒定:在線生物學(xué)軟件targetscan分析TINCR的靶基因，miR-7可能為TINCR的靶基因。構(gòu)建突變以后的TINCR熒光素酶報(bào)告載體(MUT)和沒有突變的TINCR熒光素酶報(bào)告載體(WT)，將MUT和WT分別同miR-7 mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h以后，檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性變化，檢測(cè)步驟同熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒。

1.2.7 Real-time PCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中miR-7表達(dá):收集對(duì)數(shù)期的對(duì)照、sh-NC、sh-TINCR組共3組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，按照1.2中real-time PCR方法測(cè)定miR-7表達(dá)變化，內(nèi)參設(shè)置為U6。引物：miR-7 上游引物：5′-TAACACTGTCTGGTAACGAT GT-3′，下游引物： 5′-CCAGTGCAGGGTCCG-3′。

1.2.8 檢測(cè)miR-7 inhibitor對(duì)下調(diào)TINCR的肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移影響:在肝癌Huh7細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染TINCR shRNA、inhibitor control和TINCR shRNA、miR-7 inhibitor，命名為sh-TINCR+Anti-NC、sh-TINCR+Anti-miR-7組，CCK-8法測(cè)定增殖(步驟參照1.2.3)，Transwell小室法測(cè)定遷移和侵襲(步驟參照1.2.4)，Western blot測(cè)定MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)(步驟參照1.2.5)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TINCR在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞

肝癌細(xì)胞中TINCR mRNA表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞(P<0.05)。肝癌Huh7細(xì)胞中TINCR表達(dá)水平最高(表1)。

表1 TINCR在正常肝細(xì)胞L-02和肝癌HCC9204、 Huh7、SNU449細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 TINCR shRNA可明顯下調(diào)肝癌Huh7細(xì)胞中TINCR表達(dá)水平

Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TINCR shRNA以后，細(xì)胞中TINCR表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染shRNA control后的細(xì)胞(P<0.05)。TINCR shRNA可明顯下調(diào)Huh7細(xì)胞中TINCR表達(dá)水平(表2)。

表2 TINCR shRNA轉(zhuǎn)染以后肝癌Huh7細(xì)胞中 TINCR mRNA的表達(dá)水平

2.3 下調(diào)TINCR可明顯降低Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力

Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TINCR shRNA以后，細(xì)胞A值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量均明顯低于轉(zhuǎn)染shRNA control后的細(xì)胞(P<0.05)。下調(diào)TINCR可明顯抑制肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力(圖1,表3)。

表3 TINCR shRNA轉(zhuǎn)染以后肝癌Huh7細(xì)胞的A值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目以及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量

圖1 Western blot檢測(cè)TINCR shRNA轉(zhuǎn)染以后肝癌 Huh7細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)Fig 1 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9protein expression in liver cancer Huh7 cellsafter TINCR shRNA transfection

2.4 TINCR靶向調(diào)控miR-7

TINCR和miR-7有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且肝癌Huh7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-7 mimics和TINCR-WT以后，細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于共轉(zhuǎn)染mimics control和TINCR-WT的細(xì)胞(P<0.05)。TINCR靶向調(diào)控miR-7(圖2，表4)。

圖2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)TINCR和miR-7結(jié)合位點(diǎn)Fig 2 Bioinformatics software predicts TINCR andmiR-7 binding sites

表4 WT和MUT轉(zhuǎn)染以后肝癌Huh7細(xì)胞熒光素 酶活性

2.5 下調(diào)TINCR可明顯促進(jìn)肝癌Huh7細(xì)胞中miR-7表達(dá)

肝癌Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TINCR shRNA以后，細(xì)胞中miR-7表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染shRNA control后的細(xì)胞(P<0.05)。下調(diào)TINCR可明顯促進(jìn)肝癌Huh7細(xì)胞中miR-7表達(dá)(表5)。

表5 TINCR shRNA轉(zhuǎn)染以后肝癌Huh7細(xì)胞中 miR-7表達(dá)水平

2.6 miR-7 inhibitor可明顯促進(jìn)下調(diào)TINCR的肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

與共轉(zhuǎn)染inhibitor control和TINCR shRNA的肝癌Huh7細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-7 inhibitor和TINCR shRNA后的細(xì)胞A值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平均升高(P<0.05)。miR-7 inhibitor可明顯促進(jìn)下調(diào)TINCR的肝癌Huh7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移(圖3,表6)。

表6 miR-7 inhibitor和TINCR shRNA轉(zhuǎn)染后肝癌Huh7細(xì)胞A值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和MMP-2、 MMP-9蛋白以及miR-7表達(dá)水平

3 討論

真核生物的絕大多數(shù)基因組都會(huì)被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄過程中常常產(chǎn)生沒有翻譯功能的lncRNA，lncRNA主要是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄形成的，具有調(diào)控DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、蛋白質(zhì)修飾以及影響基因轉(zhuǎn)錄等功能，lncRNA作用方式和調(diào)控機(jī)制多樣，在人體的不同生理進(jìn)程中扮演不同的角色[8]。TINCR具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其參與腫瘤發(fā)生，并且在不同的腫瘤中的研究報(bào)道不同[4-5]。TINCR在肺癌中表達(dá)上調(diào)，并且其高表達(dá)與腫瘤患者的臨床病理特征有關(guān)，下調(diào)TINCR表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移潛能[5]。TINCR在前列腺癌中扮演腫瘤抑制因子的作用，其可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。TINCR在肝癌中高表達(dá)，TINCR可能是肝癌進(jìn)展的促進(jìn)因子[6]。實(shí)驗(yàn)表明，TINCR在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞，并且下調(diào)TINCR可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，這與上述研究結(jié)果相符合，均說明TINCR在肝癌進(jìn)展中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶是存在于人體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，其可以將細(xì)胞外基質(zhì)降解而促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[9]。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞從原來的位置脫落，并隨著血管或淋巴管進(jìn)入新的組織和器官，通過惡性增殖形成轉(zhuǎn)移灶[10]。腫瘤細(xì)胞合成的基質(zhì)金屬蛋白酶是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[11]。MMP-2和MMP-9二者均是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，也是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶[12]。實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)TINCR后的肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力下降，細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平也降低，提示TINCR在肝癌轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，靶向抑制TINCR可能是抑制肝癌惡性進(jìn)展的途徑。

現(xiàn)階段對(duì)于lncRNA作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以通過靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，并且lncRNA在不同的組織以及病理進(jìn)程中的靶向調(diào)控作用可能不同[13]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TINCR靶向調(diào)控肝癌細(xì)胞系中miR-7的表達(dá)。miR-7是一個(gè)在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)的miRNA分子，過表達(dá)miR-7可以抑制肝癌細(xì)胞系的侵襲和遷移[7]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TINCR靶向調(diào)控肝癌細(xì)胞系中miR-7的表達(dá)，并且下調(diào)miR-7可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)TINCR對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，這充分證明下調(diào)TINCR抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移與靶向調(diào)控miR-7有關(guān)。

總而言之，下調(diào)TINCR抑制肝癌細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移潛能，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-7有關(guān)，目前對(duì)于其下游的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，靶向抑制TINCR表達(dá)可能是抑制肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究TINCR在腫瘤進(jìn)展中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了參考，為明確肝癌分子發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。