常順伍，韓曉玉，宮曉光，王葆春

海南省人民醫(yī)院普通外科，海南 ?？?570311

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是指肝臟組織缺血一段時(shí)間后重新恢復(fù)血流，但損傷卻進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。HIRI是肝臟外科手術(shù)常見的病理過程，同時(shí)也是導(dǎo)致肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)術(shù)后肝功能衰竭的主要原因，減輕術(shù)中HIRI有助于降低手術(shù)對(duì)肝功能的影響[2]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種酸性糖蛋白，EPO通過調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成從而增加組織供氧，對(duì)缺血再灌注器官的保護(hù)作用，但存在感染、輸血反應(yīng)等潛在危險(xiǎn)[3]。重組促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)是利用人工基因技術(shù)將EPO基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而得，研究證實(shí)rHuEPO對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障內(nèi)皮屏障抗原及通透性具有良好的保護(hù)作用[4-5]，可降低炎癥反應(yīng)及細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)，但關(guān)于rHuEPO對(duì)HIRI大鼠細(xì)胞凋亡和炎癥因子影響的研究較少，因此本文就此問題展開研究，以期為臨床上HIRI的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 高脂飼料飼養(yǎng)的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雄性SD大鼠90只，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，濕度45%～60%，室內(nèi)風(fēng)速0.1～0.2 m/s，采用隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組、模型組和rHuEPO組，每組30只。

1.2 方法

1.2.1 建模與干預(yù) 所有大鼠建模前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛400 mg/kg麻醉，仰臥位固定，常規(guī)腹部脫毛并消毒，經(jīng)陰莖背靜脈注射稀釋肝素(南京新百藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026497，規(guī)格2 mL：5 000 U)400 mg/kg，取上腹正中切口入腹后進(jìn)一步操作。假手術(shù)組：僅解剖分離肝十二指腸韌帶，不阻斷肝組織血流；模型組和rHuEPO：采用無創(chuàng)血管夾夾閉阻斷肝中葉及左肝葉建立大鼠45%減體積HIRI模型，缺血時(shí)間45 min。干預(yù)方法：rHuEPO組于缺血前24 h時(shí)腹腔注射rHuEPO(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，國藥準(zhǔn)字S20050090，規(guī)格3 000 IU/瓶)4 000 IU/kg，假手術(shù)組和模型組于缺血前24 h腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.2.2 血液及肝組織標(biāo)本采集 各組大鼠均隨機(jī)分為再灌注后1 h、3 h和6 h三個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只，均采集下腔靜脈血3 mL，在2 500 r/min下離心10 min，離心半徑6 cm，常規(guī)分離血清與血漿，留取血清、血漿保存于-20℃冰箱待測(cè)。所有大鼠在采血后處死，統(tǒng)一取左肝葉肝組織標(biāo)本待測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.3.1 肝細(xì)胞凋亡情況 肝組織標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中24 h后常規(guī)石蠟包埋切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水處理后，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling，TUNEL)標(biāo)記肝組織凋亡細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(400倍)下細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%，計(jì)算平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)表示作為凋亡指數(shù)。

1.3.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肝組織切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)；切片取新鮮左葉肝組織約1 mm3，采用戊二醛(濃度2.5%)固定，1%的鋨酸后固定，梯度乙醇脫水處理，環(huán)氧樹脂包埋超薄切片，在JEM-100CX透射電鏡(日本JEOL公司)下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)改變情況。

1.3.3 肝功能檢測(cè) 采用日立7600系列全自動(dòng)生化儀測(cè)定各亞組血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.3.4 炎癥因子檢測(cè) 采用試劑盒檢測(cè)各亞組血漿腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)，TNF-α檢測(cè)試劑盒構(gòu)圖上海晶抗生物工程有限公司，LI-1檢測(cè)試劑盒購于北京方程佰金科技有限公司，檢測(cè)中嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.5 氧化應(yīng)激檢測(cè) 采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定肝組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料均采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)、ALT、AST、TNF-α、IL-1、SOD及MDA等計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)描述，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組比較、同組內(nèi)不同亞組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 模型組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)高于rHuEPO組和假手術(shù)組，rHuEPO組高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；隨著再灌注時(shí)間的推移，模型組和rHuEPO組細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；假手術(shù)組的不同亞組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，%)

表1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s，%)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

假手術(shù)組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30 3.28±0.63 27.86±2.87c 21.38±2.62cd 15.782＜0.05 3.56±0.83 37.24±3.65ac 28.65±2.74acd 14.657＜0.05 3.41±0.72 46.92±3.88abc 32.44±3.07abcd 14.879＜0.05

2.2 各組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)變化病理觀察 光鏡下觀察顯示：與假手術(shù)組比較，模型組、rHuEPO組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯且伴有較多的空泡變性，可見間質(zhì)充血水腫伴炎性細(xì)胞浸潤，肝血竇變窄等，部分肝組織中央靜脈有不同程度的淤血，模型組的情況較rHuEPO組更嚴(yán)重。電鏡下觀察顯示：模型組、rHuEPO組細(xì)胞核呈不規(guī)則鄒縮，核染色質(zhì)明顯濃縮和向邊緣聚集，胞質(zhì)中線粒體腫脹明顯，線粒體嵴和線粒體膜被破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈不規(guī)則密集團(tuán)狀，小泡和高爾基體消失，模型組的情況較rHuEPO組更嚴(yán)重，見圖1。

2.3 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 假手術(shù)組血清ALT、AST水平低于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；隨著再灌注時(shí)間的推移，模型組和rHuEPO組血清ALT、AST水平均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；假手術(shù)組的不同亞組血清ALT、AST水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(±s，U/L)

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(±s，U/L)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組比較，c P＜00.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數(shù)ALT AST假手術(shù)組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 137.23±24.76 493.27±57.83c 278.33±44.29cd 22.783＜0.05再灌注3 h 139.83±25.87 805.29±68.92ac 425.71±48.99acd 26.485＜0.05再灌注6 h 135.52±26.13 1185.44±82.59abc 621.57±55.76abcd 31.296＜0.05再灌注1 h 180.25±33.28 689.75±66.57c 392.54±41.36cd 27.414＜0.05再灌注3 h 175.16±34.27 987.36±89.49ac 502.78±49.63acd 31.085＜0.05再灌注6 h 178.26±34.82 1328.53±95.27abc 711.44±56.59abcd 33.496＜0.05

2.4 各組大鼠炎癥因子指標(biāo)比較 假手術(shù)組血漿TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；隨著再灌注時(shí)間的推移，模型組和rHuEPO組血漿TNF-α、IL-1水平均顯著增高，再灌注3 h組高于再灌注1 h組，再灌注6 h組高于再灌注3 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；假手術(shù)組的不同亞組血漿TNF-α、IL-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血漿TNF-α、IL-1水平比較(±s，ng/L)

表3 各組大鼠血漿TNF-α、IL-1水平比較(±s，ng/L)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數(shù)TNF-α IL-1假手術(shù)組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 17.36±2.24 24.15±3.83c 19.28±2.76cd 6.572＜0.05再灌注3 h 21.59±2.36 185.47±22.38ac 104.29±17.68acd 24.279＜0.05再灌注6 h 20.33±2.13 297.56±41.57abc 198.36±31.22abcd 27.648＜0.05再灌注1 h 25.66±2.87 36.48±2.95c 30.17±3.05cd 8.472＜0.05再灌注3 h 26.82±2.91 202.57±28.53ac 126.39±20.63acd 26.574＜0.05再灌注6 h 27.05±2.89 392.64±44.52abc 201.85±26.47abcd 39.667＜0.05

2.5 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 假手術(shù)組肝組織SOD水平高于rHuEPO組和模型組，rHuEPO組高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；假手術(shù)組肝組織MDA水平低于模型度和rHuEPO組，rHuEPO組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；隨著再灌注時(shí)間的推移，模型組和rHuEPO組組織SOD水平均顯著降低，MDA水平顯著升高，再灌注3 h組與再灌注1 h組比較，再灌注6 h組與再灌注3 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；假手術(shù)組的不同亞組肝組織SOD、MDA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組大鼠肝組織SOD、MDA水平比較(±s，U/mg)

表4 各組大鼠肝組織SOD、MDA水平比較(±s，U/mg)

注：與再灌注1 h比較，a P＜0.05；與再灌注3 h比較，b P＜0.05；與假手術(shù)組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

組別 只數(shù)SOD MDA假手術(shù)組模型組rHuEPO組F值P值30 30 30再灌注1 h 113.28±9.67 51.25±6.34c 82.58±7.42cd 15.784＜0.05再灌注3 h 115.07±9.72 42.36±6.14ac 70.06±6.95acd 19.376＜0.05再灌注6 h 114.36±9.52 36.18±5.92abc 67.43±6.71abcd 21.494＜0.05再灌注1 h 5.12±0.67 14.81±2.23c 7.36±1.12cd 4.713 0.002再灌注3 h 4.83±0.61 21.36±1.85ac 14.39±1.39acd 9.782＜0.05再灌注6 h 4.80±0.44 28.46±1.49abc 20.51±1.83abcd 11.525＜0.05

3 討論

HIRI多見于需要阻斷肝臟血流的外科手術(shù)，其發(fā)生機(jī)制主要包括代謝性酸中毒、氧自由基增多、中性粒細(xì)胞表達(dá)上調(diào)、鈣超載、及細(xì)胞因子表達(dá)異常等[6-7]。一般情況下，HIRI是術(shù)后肝功能異常、原發(fā)性移植肝無功能、肝功能衰竭的重要原因。因此，如何有效預(yù)防HIRI是手術(shù)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前尚無治療HIRI的有效方法，有研究表明，通過再灌注前給藥及缺血預(yù)處理可不同程度減輕肝損傷程度[8-9]。脂肪肝對(duì)HIRI更敏感，術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)更大[10]。rHuEPO的主要成分是促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)，目前臨床上主要用于治療貧血，其刺激骨髓生成紅細(xì)胞以及對(duì)心肌、腦、腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已被廣大學(xué)者的研究予證實(shí)[11-12]。rHuEPO對(duì)脂肪肝缺血再灌注損傷后肝細(xì)胞凋亡及炎癥因子的影響及機(jī)制目前尚不明確。

本研究顯示，相對(duì)于假手術(shù)組而言，模型組和rHuEPO組均存在肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，而模型組改變情況較rHuEPO組更嚴(yán)重，說明HIRI后存在肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)改變，而rHuEPO預(yù)處理能一定程度抑制這種改變，從而發(fā)揮了保護(hù)肝功能的作用。模型組各亞組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)高于rHuEPO組和假手術(shù)組相同時(shí)相的各亞組，說明HIRI后存在肝細(xì)胞凋亡情況，通過rHuEPO預(yù)處理能較大程度抑制肝細(xì)胞凋亡，可以作為提高脂肪肝手術(shù)安全性和改善預(yù)后的方案之一。ALT和AST是肝功能檢查的兩項(xiàng)常用指標(biāo)，當(dāng)肝臟受損時(shí)，可引起ALT和AST水平升高[13-14]。本研究顯示，假手術(shù)組各亞組血清ALT、AST水平低于rHuEPO組和模型組相同時(shí)相的各亞組，rHuEPO組各時(shí)相亞組均低于模型組相同時(shí)相的各亞組，說明HIRI后存在肝功能損傷，而通過rHuEPO預(yù)處理可一定程度上保護(hù)肝功能。rHuEPO對(duì)脂肪肝HIRI后肝功能的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚，有研究顯示，rHuEPO不能直接促進(jìn)抗凋亡信號(hào)通路和誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bul-2)信使RNA表達(dá)，rHuEPO對(duì)HIRI后肝臟的保護(hù)作用不是直接作用于肝細(xì)胞，可能通過其他機(jī)制發(fā)揮作用[15-16]。

過度炎癥反應(yīng)是缺血再灌注后肝損傷的主要機(jī)制之一，抑制缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)可減輕肝臟損傷[17-18]。TNF-α、IL-1是兩種重要的炎癥因子，通過促進(jìn)白細(xì)胞局部聚集與活化、誘導(dǎo)黏附分子及趨化因子表達(dá)等多種途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其表達(dá)水平上調(diào)可增大缺血再灌注損傷程度。本研究顯示，假手術(shù)組各亞組血漿TNF-α、IL-1水平低于rHuEPO組和模型組相同時(shí)相的各亞組，rHuEPO組各時(shí)相亞組均低于模型組相同時(shí)相的各亞組，說明HIRI后存在過度炎癥反應(yīng)情況，rHuEPO預(yù)處理可一定程度抑制脂肪肝缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)。SOD是體內(nèi)重要的氧化酶，肝臟缺血再灌注是其活性降低；MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，其水平反映了氧化應(yīng)激損傷程度[19]。本研究顯示，假手術(shù)組各亞組肝組織SOD水平高于rHuEPO組和模型組相同時(shí)相的各亞組，rHuEPO組各亞組高于模型組相同時(shí)相的各亞組；假手術(shù)組各亞組肝組織MDA水平低于模型度和rHuEPO組相同時(shí)相的各亞組，rHuEPO組各亞組低于模型組相同時(shí)相的各亞組，肝臟缺血再灌注過程存在過度氧化應(yīng)激反應(yīng)，rHuEPO預(yù)處理可一定程度抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，rHuEPO可能通過抑制大鼠脂肪肝缺血—灌注過程中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮對(duì)肝功能的保護(hù)作用，能一定程度抑制肝細(xì)胞凋亡。