吳紅波，穆曉倩，吳慧娟，陳利娟，劉杰，胡秀峰，趙艷秋

河南省腫瘤醫(yī)院（鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院）呼吸內(nèi)科，鄭州4500000

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，2015年中國肺癌病死率為39.81/10萬，病死率高、預(yù)后較差[1]，近年來肺癌發(fā)病率和病死率均呈逐漸增高的趨勢[2]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見的類型，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，對出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，5年生存率明顯降低[3]?；熓欠伟┠壳爸饕闹委煼桨钢?，含鉑的雙藥化療方案是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，能提高晚期肺癌患者化療客觀有效率和疾病控制率，延長晚期肺癌患者的無進(jìn)展生存期[4]。研究表明，化療藥物能明顯影響患者機(jī)體免疫功能[5]。肺癌患者的外周血淋巴細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞等亞群水平對預(yù)后具有重要影響，外周血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+是肺癌患者預(yù)后的影響因素[6]。本研究旨在通過分析肺癌多周期化療中外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化及T細(xì)胞表面共抑制分子變化，了解機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，為臨床個(gè)體化的腫瘤免疫治療提供初步的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2018年1月于河南省腫瘤醫(yī)院就診的肺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為肺癌，既往未行其他腫瘤治療及影響免疫功能的藥物治療；②行為狀態(tài)良好，卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分≥70分，生存時(shí)間大于3個(gè)月；③具有計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）可測量的腫瘤病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎等器官功能障礙；②伴有急性感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾?。虎垡蚧熯^程中疾病進(jìn)展轉(zhuǎn)二線治療，未完成5個(gè)周期化療或失訪。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入124例肺癌患者，男性73例，女性51例；年齡37～78歲，中位年齡58歲；肺腺癌63例，鱗狀細(xì)胞癌31例，小細(xì)胞肺癌30例；I期23例，Ⅱ期16例，Ⅲ期34例，Ⅳ期51例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移85例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。

1.2 化療方法

所有患者均經(jīng)連續(xù)5個(gè)周期化療后進(jìn)行療效評價(jià)，化療前及最后一次化療后1個(gè)月行CT或磁共振成像（MRI）檢查評價(jià)療效，隨時(shí)評價(jià)不良反應(yīng)。I期、Ⅱ期和Ⅲ期的73例患者均為術(shù)后輔助化療；Ⅳ期51例患者均予以標(biāo)準(zhǔn)化療?；煼桨覆扇『K類雙藥化療，非小細(xì)胞肺癌采用吉西他濱+順鉑（GP）方案（第1、8天予吉西他濱1000 mg/m2，第1～3天予以順鉑35 mg/m2，每3周為一個(gè)周期）或長春瑞濱+順鉑（NP）方案（第1、8天予長春瑞濱25 mg/m2，第1～3天予以順鉑35 mg/m2，每3周為一個(gè)周期），小細(xì)胞肺癌采用依托泊苷+順鉑（EP）方案（第1、8天予順鉑35 mg/m2，第1～3天予以依托泊苷100 mg/m2，每3周為一個(gè)周期）。

1.3 檢測指標(biāo)

應(yīng)用BD FACSanto流式細(xì)胞儀及流式抗體（購自美國BD公司）檢測所有患者連續(xù)5個(gè)化療周期化療前及化療后1個(gè)月（以排除化療對免疫細(xì)胞的一過性殺傷作用）晨起空腹外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、B 細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞水平及程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）、淋巴細(xì)胞活化基因 3（lymphocyte activating gene 3，LAG-3）表達(dá)水平。檢測具體操作步驟：5 ml全血加入抗凝劑抗凝，與10 μl相應(yīng)抗體混勻，同型對照，室溫下避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液，室溫下避光5～10 min，離心5 min后棄上清，洗滌2次加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并上機(jī)檢測。采用流式細(xì)胞微球陣列術(shù)試劑盒（購自美國BD公司）檢測所有患者各周期化療后外周血白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用梯度法稀釋各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)液，加入微球混合液和藻紅蛋白熒光染液，混勻后避光3 h，加入洗液后離心棄上清，上機(jī)檢測各標(biāo)本細(xì)胞因子濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及 T細(xì)胞表面共抑制分子水平變化趨勢

124例患者在5個(gè)周期化療過程中，外周血CD4+T細(xì)胞明顯增加（F=12.347，P=0.000），CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞減少（F=5.425、4.237、3.021，P=0.000、0.002、0.012），PD-1水平明顯提高（F=5.123，P=0.002）；CTLA-4、LAG-3水平無明顯差異（F=1.247、0.648，P=0.279、0.574）。（表1）

2.2 細(xì)胞因子水平變化

124例肺癌患者5個(gè)周期化療過程中，各周期化療后外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及IFN-γ水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

2.3 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及共抑制分子表達(dá)水平與肺癌臨床分期、分化程度的關(guān)系

Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分別低于I～Ⅱ期、高中分化患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.698、2.567，P＜0.05）；不同臨床分期及分化程度的肺癌患者CD3+、CD4+、CD8+、LAG-3、CTLA-4、PD-1、B細(xì)胞、NK細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表1 124例肺癌患者各周期化療中淋巴細(xì)胞亞群及 T細(xì)胞表面共抑制分子水平（±s）

表1 124例肺癌患者各周期化療中淋巴細(xì)胞亞群及 T細(xì)胞表面共抑制分子水平（±s）

指標(biāo)CD4+CD8+B細(xì)胞NK細(xì)胞PD-1 CTLA-4 LAG-3 36.15±10.86 25.14±7.04 10.38±3.43 14.12±8.02 11.78±5.32 2.47±1.45 2.72±1.60 41.33±11.31 23.61±7.33 10.02±4.63 13.15±7.46 12.02±4.35 2.84±1.71 2.49±1.22 44.02±12.87 22.61±6.79 9.81±2.95 12.20±8.27 14.18±5.01 2.67±1.53 2.37±1.57 51.39±12.60 21.63±6.63 8.17±2.91 11.08±7.84 15.01±6.82 2.78±1.64 2.26±1.89 54.52±10.11 19.84±6.59 7.25±2.34 9.56±5.46 17.44±8.17 2.60±1.91 2.50±1.46化療第一周期化療第二周期化療第三周期化療第四周期化療第五周期

表2 124例肺癌患者各周期化療后外周血細(xì)胞因子水平（pg/ml，±s）

表2 124例肺癌患者各周期化療后外周血細(xì)胞因子水平（pg/ml，±s）

指標(biāo)TNF-αIFN-γIL-2IL-4IL-6IL-10IL-17 2.83±0.80 6.91±2.64 2.10±0.41 3.10±1.12 10.78±5.32 3.87±1.45 22.02±15.60 2.76±0.92 6.87±2.71 2.12±0.53 3.15±1.06 11.02±4.65 3.64±1.55 21.38±16.62 2.79±0.75 6.86±2.57 2.13±0.45 3.20±1.26 10.11±6.10 3.90±1.63 23.27±14.57 2.81±0.83 6.90±2.63 2.08±0.36 3.08±1.37 11.21±6.12 3.78±1.64 22.26±13.89 2.77±0.93 6.89±2.31 2.23±0.64 3.19±1.64 10.56±5.89 3.90±1.81 22.50±15.46化療第一周期化療第二周期化療第三周期化療第四周期化療第五周期

3 討論

以鉑類為主的聯(lián)合化療是肺癌重要的治療方式之一，可以減輕患者臨床癥狀，改善生活質(zhì)量，延長生存時(shí)間，但傳統(tǒng)化療在腫瘤治療中缺乏特異性，易出現(xiàn)各種化療相關(guān)不良反應(yīng)，為實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化治療，許多學(xué)者利用各種分子指標(biāo)和免疫指標(biāo)對腫瘤患者進(jìn)行評估，指導(dǎo)臨床治療。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與機(jī)體免疫功能異常密切相關(guān)，近年來隨著腫瘤免疫研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多腫瘤患者體內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量異常及細(xì)胞表面抑制性受體表達(dá)異常，參與腫瘤的免疫逃逸等過程[8]。腫瘤免疫治療通過調(diào)整機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力，在許多腫瘤治療中獲得較好的臨床療效[9]。

以往有研究表明，肺癌組患者與健康對照組相比，CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+明顯較低[10]，CD3分子與T細(xì)胞識別抗原形成復(fù)合物，通過結(jié)合抗原傳遞活化信號，是T細(xì)胞表面標(biāo)記。CD4+T細(xì)胞是一種輔助性T細(xì)胞，協(xié)助機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。有研究表明，肺癌患者在多種免疫抑制因素作用下處于免疫抑制狀態(tài)，抑制CD3+、CD4+的分化成熟，進(jìn)而減少 CD3+、CD4+數(shù)量[11]。本研究中分析了肺癌組患者化療前淋巴細(xì)胞亞群水平與臨床分期及分化程度的關(guān)系，結(jié)果表明Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分別低于I～Ⅱ期、高中分化患者，與以往研究一致[12]，其機(jī)制可能與高分期、低分化腫瘤負(fù)荷大，腫瘤產(chǎn)生較多免疫抑制因子有關(guān)。在連續(xù)5個(gè)周期化療過程中，患者外周血CD4+T細(xì)胞明顯增加，CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞明顯減少，與國內(nèi)研究報(bào)道一致[13]，其機(jī)制可能與腫瘤患者細(xì)胞免疫功能受到抑制，輔助識別和直接殺傷腫瘤細(xì)胞功能下降，機(jī)體處于對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)有關(guān)[14]。此外，化療后腫瘤負(fù)荷降低，腫瘤產(chǎn)生的抑制免疫系統(tǒng)的物質(zhì)減少。化療引起的淋巴細(xì)胞水平降低能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，這種自穩(wěn)性增生能夠增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答[15]。腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞在各種刺激、因子作用下均可產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-10、IL-6參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，IL-2參與巨噬細(xì)胞極化為M2型，與腫瘤細(xì)胞的免疫耐受有關(guān)。本研究中對肺癌患者多周期化療過程中外周血細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及 IFN-γ進(jìn)行檢測，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與外周血細(xì)胞因子檢測特異度低有關(guān)，進(jìn)一步檢測腫瘤局部微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞因子表達(dá)情況，可能有助于解釋細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制。

表3 不同臨床分期及分化程度肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及共抑制分子表達(dá)水平（±s）

表3 不同臨床分期及分化程度肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及共抑制分子表達(dá)水平（±s）

指標(biāo)臨床分期I～Ⅱ（n=39）Ⅲ～Ⅳ（n=85）分化程度高中分化（n=53）低分化（n=71）CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+LAG-3 CTLA-4 PD-1 B細(xì)胞NK細(xì)胞69.7±11.1 36.4±11.5 25.2±7.8 1.6±0.7 2.6±1.5 2.8±1.9 13.2±3.4 12.2±2.7 17.8±3.9 65.0±9.8 37.5±10.1 28.7±5.8 1.3±0.6 2.4±2.1 2.6±2.0 11.9±5.2 10.2±2.1 15.8±4.7 66.2±12.8 37.1±9.1 26.7±8.8 1.5±0.5 2.5±2.0 2.6±1.9 13.9±6.4 11.1±3.9 16.7±4.0 64.9±12.3 35.9±10.4 24.9±5.8 1.3±0.7 2.4±2.2 2.5±1.9 11.9±6.8 11.8±3.0 15.2±3.9

本研究患者在5個(gè)周期化療過程中，PD-1水平明顯增加。PD-1位于活化T細(xì)胞表面，與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）結(jié)合，激活PD-1/PD-L1信號通路，誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞凋亡，腫瘤局部形成免疫抑制性的微環(huán)境。以往研究亦證實(shí)，腫瘤微環(huán)境中的LAG-3、CTLA-4及PD-1等細(xì)胞表面共抑制分子表達(dá)水平增加，可導(dǎo)致殺傷腫瘤細(xì)胞功能下降，表現(xiàn)為穿孔素及顆粒酶分泌能力降低，T細(xì)胞免疫監(jiān)視功能下降，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[16]。化療后T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖活化有關(guān)。有研究表明，PD-1高表達(dá)時(shí)存在T細(xì)胞耗竭，T細(xì)胞功能受抑制，與患者較短的生存時(shí)間和不良預(yù)后密切相關(guān)[17]。

綜上所述，研究肺癌多周期化療中外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量變化及T細(xì)胞表面共抑制分子變化，對于了解機(jī)體免疫狀態(tài)的變化，選擇敏感患者予以免疫治療具有重要意義，有待進(jìn)一步研究。