王海明，王建華

天津中醫(yī)藥大學附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院外科，天津3004000

膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是來源于膽管上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居原發(fā)性膽道惡性腫瘤的首位，占惡性腫瘤的2%[1-2]。CCA根據解剖位置可分為肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCAA）、肝門周圍膽管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）和遠端膽管癌（distal cholangiocarcinoma，dCCA）。CCA具有早期癥狀不典型、易浸潤轉移等特征，多數患者就診時已為晚期，預后極差。據報道，歐洲iCCA和肝外膽管癌的5年生存率分別為5%和17%[3]。盡管近年來CCA診斷和治療技術有所改善，但根治性手術切除或肝移植仍然是早期階段治療的唯一方法。目前CCA的診斷缺乏特異性生物標志物或特殊臨床表現，臨床治療無有效的分子靶向制劑，這些困難主要是由于其分子發(fā)病機制尚未清楚。故為了改善CCA診斷、監(jiān)測進展和預測潛在藥物治療靶點等，迫切需要闡明CCA的分子發(fā)病機制。微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為18～25 nt的內源性、高度保守的非編碼單鏈RNA[4]。目前研究表明，miRNA參與調控癌癥的多種生物學過程，其主要是通過在轉錄后水平調控機體基因表達。大量研究表明，miRNA在CCA中表達失調，研究miRNA有助于進一步探索CCA的分子發(fā)病機制，為未來CCA早期診斷和治療提供新的方向和理念。

1 miRNA在惡性腫瘤中的調控機制和作用

1.1 miRNA在機體中的調控機制

miRNA是非編碼RNA的亞組，在從調控昆蟲生長到哺乳動物中X染色體失活等一系列機體生物學過程中發(fā)揮著重要作用。目前研究證實，miRNA可以在細胞內和細胞外調控基因表達。細胞內miRNA通過與靶信使RNA（messenger mRNA）3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）結合，將miRNA嵌入與其相關的RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中，并在轉錄后水平的基因表達中發(fā)揮重要作用，此種相互作用導致翻譯抑制或mRNA降解。單個miRNA可以靶向調控數百個潛在mRNA靶標，并且單個mRNA亦可以聚集在一個以上的miRNA上。以上亦是一種特定miRNA可以調控多個基因并影響多種細胞進程的原因[5]。

miRNA不僅在細胞內調控基因表達，也可分泌出來通過縫隙連接與相鄰細胞進行信息轉導。部分miRNA以自由循環(huán)的方式從細胞中釋放，后與載體蛋白相結合，存在于細胞外囊泡中。細胞外囊泡將miRNA、脂質和蛋白質等小分子物質運輸到受體細胞，其膜通過內吞作用與靶細胞膜融合，將其內容物釋放到細胞質中發(fā)揮調控作用[6-7]。目前研究表明，細胞外囊泡中某些miRNA呈選擇性分泌，提示胞外miRNA可能發(fā)揮更高級的調控作用。

1.2 miRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

miRNA是一類小分子非編碼RNA，在癌癥發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移和耐藥等方面均起著重要作用。據文獻報道，人類超過30%的蛋白質編碼基因受到miRNA調控，從而進一步控制細胞的整體生物學過程，如細胞增殖、分化和凋亡，參與腫瘤發(fā)生的動態(tài)多步驟過程。目前研究已證實，惡性腫瘤患者體內miRNA表達失調，其主要機制包括染色體異常、轉錄控制變化、表觀遺傳變化和miRNA生物發(fā)生機制缺陷。miRNA根據其靶基因，在特定條件下可以作為致癌因子或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。在惡性腫瘤中上調的miRNA可作為致癌因子通過逃避生長抑制因子作用并維持增殖信號轉導等途徑而促進腫瘤發(fā)生和進展；下調的miRNA可作為腫瘤抑制因子負向調控腫瘤。

2 miRNA在CCA中的調控機制

miRNA在CCA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調控作用，但是其機制尚不清楚。探究miRNA與CCA之間的關系可以為其發(fā)病分子機制和臨床實踐提供新的思路。

2.1 miRNA對CCA細胞增殖和凋亡的調控機制

腫瘤細胞的增殖和凋亡調控是腫瘤發(fā)生的關鍵機制之一，而miRNA可通過調節(jié)腫瘤細胞增殖或凋亡的關鍵基因功能而影響腫瘤發(fā)展。miRNA是調節(jié)基因表達的內源性RNA分子，體內外研究發(fā)現其在CCA細胞及組織中表達異常。目前研究已經明確，CCA細胞系中miRNA-21、miRNA-141、miRNA-26a和miRNA-200b等多種miRNA呈高表達，而miRNA-29b、miRNA-122和miRNA-590-3p等呈低表達[8-10]。有研究表明，miRNA-141靶向調控時鐘基因（clock gene，CLOCK），通過調控晝夜節(jié)律和抑制腫瘤細胞分裂而促進細胞凋亡。因此，抑制miRNA-141表達可以增加CLOCK基因的表達，從而促進CCA細胞的增殖并抑制其凋亡，促進CCA的發(fā)生發(fā)展。免疫逃逸是腫瘤細胞的生物學特征之一。miRNA-29b可增加CCA細胞的抗凋亡活性[9]。Mott等[10]研究表明，miRNA-29b在CCA細胞系KMCH中通過抑制抗細胞凋亡家族成員髓細胞白血病 1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）表達，增強KMCH細胞對腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的敏感性并誘導細胞凋亡。進一步研究發(fā)現，c-Myc和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路均可以調控miRNA-29表達，導致CCA細胞凋亡。故提高miRNA-29的表達水平可通過以上機制促進CCA細胞的凋亡，抑制CCA的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖關系密切。在CCA細胞系RBE和QBC939中，miRNA-138以轉移基因Ras同源類似物C（RhoC）為靶點發(fā)揮調控作用，將miRNA-138轉染入CCA細胞導致RhoC表達降低，抑制CCA細胞增殖，從而改善CCA細胞惡性進展[11]。隨著研究深入發(fā)現，miRNA-421和miRNA-24分別通過調控腫瘤抑制蛋白法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）和多發(fā)性內分泌癌蛋白基因編碼蛋白Menin，影響CCA細胞增殖[12-13]。

細胞周期在細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，細胞周期調控失?？赡軐е录毎惓５蛲龊驮鲋?。Olaru等[14]通過多種實驗方法證實，miRNA-494在CCA組織中呈低表達狀態(tài)。流式細胞周期分析顯示，miRNA-494通過調控細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/6）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、細胞周期蛋白E2（cyclin E2，CCNE2）和組蛋白去乙?；?1（histone deacetylase 1，HDAC1）等多個靶基因表達干擾CCA細胞G1/S周期阻滯細胞增殖。另一項研究表明，miRNA-494在CCA細胞G2/M期中起著重要的負向調控作用。蛋白質印跡法實驗結果顯示，miRNA-494通過調控Polo樣激酶-1（Pololike kinase 1，PLK1）、垂體腫瘤轉化基因 1（pituitary tumor-transforming gene 1，PTTG1）、細胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）、細胞分裂周期蛋白2/20（cell-division cycle 2/20，CDC2/20）和拓撲異構酶Ⅱα（topoisomerase-Ⅱα，TOP2A）等多個 G2/M 期基因，致使CCA細胞延緩在G2/M期[15]。以上研究得出，miRNA-494通過影響細胞周期G1/S和G2/M期，在調控細胞增殖中發(fā)揮重要作用。miRNA與CCA分子發(fā)病機制之間存在密切關系。但目前多數研究都集中在CCA的單一時間點。Chen等[16]利用miRNA實時活性監(jiān)測技術，檢測了miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-21、miRNA-146a、miRNA-155和miRNA-221 6種miRNA的動態(tài)活性，結果表明，此6種miRNA的功能是暫時性的，且表達水平隨時間而變化。雖然這項研究有一定局限性，但為CCA發(fā)病機制的研究提供了一新視角。

2.2 miRNA對CCA上皮-間充質轉化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）的調控機制

腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個復雜、多步驟和動態(tài)的生物學事件。EMT被認為是腫瘤轉移級聯(lián)中的早期和關鍵步驟。目前研究證實，miRNA在腫瘤EMT中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現，miRNA-21在CCA細胞系中過表達可影響上皮標志物（E-鈣黏蛋白）和間充質標志物（N-鈣黏蛋白、波形蛋白）的表達，提示miRNA-21可間接或直接調控CCA細胞EMT[17]。近來研究發(fā)現，miRNA-21的表達是通過EMT信號轉導途徑的調控起作用，并且通過敲除QBC939細胞中miRNA-21證實，Krüppel樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）基因是其作用靶點[18]。實驗表明，miRNA-204過表達可通過靶向調控SNAI2基因逆轉CCA細胞EMT過程，從而抑制CCA細胞遷移侵襲[17]。miRNA-34a作為一種抑癌miRNA，可以靶向調控多種信號轉導途徑下游分子發(fā)揮作用。Smad同源物4（mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4）是一種轉錄因子，是轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號轉導的中心環(huán)節(jié)。SMAD4參與細胞增殖、分化、遷移和凋亡，介導上皮細胞與基質炎性細胞間的相互作用。研究發(fā)現，CCA組織中SMAD4和miRNA-34a在蛋白水平呈反向關系；通過細胞實驗發(fā)現，miRNA-34a過表達通過TGF-β/SMAD途徑靶向調控SMAD4，致使E-鈣黏蛋白表達增加和N-鈣黏蛋白表達減少，提示miRNA-34a通過TGF-β/SMAD途徑靶向調控SMAD4抑制人CCA細胞EMT，抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。δ樣蛋白1（delta like protein 1，DLL1）是Notch通路配體，miRNA-34a通過負向調控DLL1，影響腫瘤細胞EMT[19]。以上研究表明miRNA在CCA的EMT中發(fā)揮著重要調控作用。

EMT是一系列復雜的調控過程，其他轉錄因子和信號通路亦可參與CCA細胞EMT的發(fā)生。磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一種重要的抑癌基因，參與EMT的調節(jié)過程。miRNA-221直接調控PTEN，后者激活β-連環(huán)蛋白，促進CCA細胞發(fā)生EMT，影響腫瘤細胞的侵襲轉移[20]。miRNA-200b/c通過調節(jié)E盒鋅指結合蛋白1/2（zinc finger E-box binding homeobox 1/2，ZEB1/2）-E鈣黏蛋白軸促進CCA入侵，間接提示miRNA-200b/c可能影響CCA細胞EMT[21]。Li等[22]研究證實，miRNA-214直接靶向調節(jié)轉錄因子Twist，導致E-鈣黏蛋白降低，間接影響EMT。綜上，miRNA同時可以間接影響CCA的EMT。

2.3 miRNA對CCA相關致病因素的調控機制

炎癥是導致腫瘤發(fā)生和進展的確切因素之一，且炎癥環(huán)境可以影響腫瘤表觀遺傳學的改變。目前研究證實，細胞因子、生長因子、酪氨酸激酶等在炎癥條件下具有促進CCA發(fā)生發(fā)展的作用。白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）是炎癥相關細胞因子，通過多種機制促進腫瘤進展。Meng等[23]通過體外實驗證實，miRNA let-7a通過調控信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化增強IL-6活性，且靶向調控編碼腫瘤抑制基因神經纖維瘤病2（neurofibromatosis 2，NF2）基因。進一步研究發(fā)現，IL-6可通過靶向調控miRNA-370促進腫瘤生長。An等[24]通過等位基因丟失分析發(fā)現，CCA組織中miRNA let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b簇呈低表達；miRNA let-7c/miRNA-99a/miRNA-125b水平升高在體內和體外可抑制CCA細胞遷移和侵襲；同時該簇通過調控IL-6受體和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）抑制IL-6/STAT3炎癥途徑。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）是前列環(huán)素形成中起關鍵作用的一種重要的炎性因子。miRNA-101過表達抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和COX-2表達水平，導致異種移植模型中的腫瘤生長減緩。研究發(fā)現miRNA-21靶向調控15-羥基前列腺素脫氫酶（15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase，15-PGDH），對基于前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的COX-2轉化至關重要。此外，PGE2可以進一步促進miRNA-21表達形成正反饋環(huán)[25]。因此，阻斷miRNA-21/COX-2/PGE2信號轉導可以為治療CCA提供有希望的治療策略。提示miRNA可以通過多種途徑調控炎性反應影響CCA。

晝夜節(jié)律調控在機體生理活動和細胞行為過程中起著重要作用，眾多細胞轉錄組和蛋白質組以晝夜節(jié)律的方式進行。晝夜節(jié)律調節(jié)主要是通過CLOCK和NPAS2等蛋白實現的。細胞晝夜節(jié)律紊亂是多種癌癥的發(fā)病風險因素。有研究通過生物信息學技術分析預測得出miRNA-141可能在iCCA中過表達，且通過靶向調控CLOCK基因發(fā)揮作用[12]。Han等[26]研究發(fā)現miRNA-34a在CCA細胞中呈節(jié)律性表達，其通過增加Per1蛋白表達水平抑制miRNA-34a進而抑制CCA細胞增殖、遷移和侵襲。提示miRNA可以通過調控細胞晝夜節(jié)律的形式影響CCA的發(fā)生和發(fā)展。

3 miRNA作為CCA預后生物學標志物

CCA惡性程度高，預后差，容易并發(fā)早期局部淋巴結轉移和遠處轉移。臨床上影響CCA患者預后的獨立因素包括：腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度和手術方式等。隨著對miRNA研究的深入發(fā)現，特定miRNA可以作為CCA預后判斷的獨立生物學標志物。Cheng等[27]通過對95例CCA患者血液標本進行檢測發(fā)現，血清循環(huán)miRNA-106a的低表達水平與切除后淋巴結轉移情況相關，通過Cox比例風險模型分析證實miRNA-106a表達水平是影響CCA患者總體生存率（OS）的獨立預后因素。Wang等[28]通過對66例CCA患者和健康人群進行比較發(fā)現，miRNA-26a在CCA患者中較健康人群呈顯著高表達（P＜0.01），且與CCA臨床分期、腫瘤分化狀態(tài)密切相關。血清高miRNA-26a表達水平亦是判斷CCA患者OS和無進展生存的獨立預測因子。Li等[29]通過對CCA組織和癌旁組織進行逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測發(fā)現，miRNA-203在CCA組織中呈低表達，且與腫瘤大小、腫瘤分化程度及臨床分期密切相關；進一步分析表明，miRNA-203表達水平可作為CCA患者OS的獨立影響因素。McNally等[30]研究發(fā)現，在CCA組織中miRNA-126和miRNA-151-3p表達失調，且可作為影響OS的預后標志物。盡管目前已經嘗試提供相關預后miRNA譜，但是尚未在臨床中大規(guī)模應用。

4 miRNA與CCA化療耐藥性

CCA多藥耐藥性是一個多因素過程，是由眾多表觀遺傳因素參與的調控細胞存活和凋亡平衡的過程。研究報道，miRNA-21和miRNA-200b過表達可能影響磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/PTEN信號通路，增加吉西他濱的藥物抗性[12]。體外研究發(fā)現，恢復CCA細胞系中miRNA-29b、miRNA-205、miRNA-221的表達水平可增強吉西他濱的藥物敏感性，其機制可能是靶向調控磷脂酰肌醇3-激酶調節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase，regulatory subunit 1，PIK3R1）和基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）。另有研究表明，miRNA let-7a靶向調控NF2可增加吉西他濱毒性[29]。miRNA-200b/c的過表達可通過靶向調控Zeste12同源物1抑制因子2（suppressorof zeste 12 homolog，SUZ12）和Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶-2（Rho-associated coiled-coil protein kinase-2，ROCK2）增加5-氟尿嘧啶對CCA細胞的敏感性。Li等[31]研究證實，miRNA-199a-3p的表達水平對順鉑條件下CCA細胞系凋亡情況具有顯著影響，其主要是通過作用于雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）靶點。Asukai等[32]發(fā)現，抑制miRNA-130a-3p表達可恢復CCA細胞系對吉西他濱的藥物抗性，間接表明miRNA-130a-3p表達水平可以作為預測CCA細胞對吉西他濱敏感性的標志物。

綜上所述，CCA目前仍然是最致命的惡性疾病之一。近年來，miRNA在CCA發(fā)生和發(fā)展中的分子機制不斷被揭示，新型分子治療靶點被挖掘，為進一步研究CCA的發(fā)病、診斷、治療及預后等提供了新方向，為基因治療開拓了新思路。但是miRNA在CCA中的分子作用機制尚不明確，仍有多種新型miRNA及其機制需進一步探究。